Жіночий інформаційний портал / Лікування / До складу малих інтерферуючих рНК не входять. Про всі рНК у світі, великих і малих

До складу малих інтерферуючих рНК не входять. Про всі рНК у світі, великих і малих

24.07.2023

У живій клітині потік інформації між ядром і цитоплазмою ніколи не вичерпується, проте розуміння всіх його «завихрень» і розшифрування закодованої в ньому інформації – воістину титанічна задача. Одним із найважливіших ривків у біології минулого століття можна вважати відкриття молекул інформаційних (або матричних) РНК (іРНК або мРНК), які є посередниками, які переносять інформаційні «повідомлення» з ядра (з хромосом) в цитоплазму. Визначальна роль РНК у синтезі білків було передбачено ще 1939 року у роботі Торбьорна Касперссона ( Torbjörn Caspersson), Жана Брачета ( Jean Brachet) та Джека Шульца ( Jack Schultz), а в 1971 році Джордж Марбайс ( George Marbaix) запустив синтез гемоглобіну в ооцитах жаби, зробивши ін'єкцію вперше виділеної матричної РНК кролика, що кодує цей білок.

У 1956-1957 роках у Радянському Союзі А. Н. Білозерський та А. С. Спірін незалежно довели існування мРНК, а також з'ясували, що основну масу РНК у клітині становить аж ніяк не матрична, а рибосомальна РНК(РРНК). Рибосомальна РНК – другий «головний» вид клітинної РНК – утворює «скелет» та функціональний центр рибосом у всіх організмів; саме рРНК (а чи не білки) регулює основні етапи білкового синтезу. Одночасно було описано та вивчено і третій «головний» вид РНК – транспортні РНК (тРНК), які у комплексі з двома іншими – мРНК та рРНК – формують єдиний білок-синтезуючий комплекс. Згідно з досить популярною гіпотезою «світу РНК», саме ця нуклеїнова кислота лежала біля витоків життя на Землі.

У зв'язку з тим, що РНК значно більш гідрофільна порівняно з ДНК (за рахунок заміни дезоксирибози на рибозу), вона більш лабільна і може відносно вільно переміщатися в клітині, а значить і доставляти короткоживучі репліки генетичної інформації (мРНК) до місця, де починається білковий синтез. Однак варто відзначити і пов'язане з цим «незручність» – РНК дуже нестабільна. Вона набагато гірша, ніж ДНК, зберігається (навіть усередині клітини) і деградує за найменшої зміни умов (температура, рН). Крім «власної» нестабільності, великий внесок належить рибонуклеазам (або РНКазам) - класу ферментів, що розщеплюють РНК, дуже стабільних і «всюдисущих» - навіть шкіра рук експериментатора містить достатню кількість цих ферментів, щоб перекреслити весь експеримент. Через це працювати з РНК набагато складніше, ніж з білками або ДНК – остання взагалі може зберігатися сотні тисяч років практично без пошкоджень.

Фантастична акуратність при роботі, тридистилят, стерильні рукавички, одноразовий лабораторний посуд - все це необхідно для запобігання деградації РНК, проте дотримання таких стандартів не завжди було можливим. Тому довгий час на короткі «уламки» РНК, які неминуче забруднювали розчини, просто не звертали уваги. Однак згодом стало ясно, що, незважаючи на всі зусилля щодо підтримки стерильності робочої області, «уламки» закономірно продовжували виявлятися, а потім з'ясувалося, що в цитоплазмі завжди присутні тисячі коротких дволанцюжкових РНК, які виконують певні функції, і абсолютно необхідні для нормального розвитку клітини та організму.

Принцип РНК-інтерференції

Можливістю застосування киРНК зацікавилися і фармацевти, оскільки здатність спрямованої регуляції роботи окремих генів обіцяє нечувані перспективи лікування маси захворювань. Невеликий розмір та висока специфічність дії обіцяють високу ефективність та низьку токсичність ліків на основі кіРНК; однак вирішити проблему доставкикиРНК до хворих клітин у організмі поки що не вдалося - виною тому крихкість і недовговічність цих молекул. І хоча зараз десятки колективів намагаються знайти спосіб спрямовувати ці «чарівні кулі» точно в ціль (всередину хворих органів), видимих успіхів вони поки що не досягли. Окрім цього, є й інші складнощі. Наприклад, у разі антивірусної терапії висока вибірковість дії кіРНК може надати «ведмежу послугу» - оскільки віруси швидко мутують, змінений штам дуже швидко втратить чутливість до кіРНК, підібраної на початку терапії: відомо, що заміна лише одного нуклеотиду в кіРНК призводить до суттєвого зниження ефект інтерференції.

Тут варто нагадати ще раз - киРНК були виявлені тільки у рослин, безхребетних та одноклітинних; хоча гомологи білків для РНК-інтерференції (Dicer, RISC-комплекс) є і у вищих тварин, киРНК звичними методами не виявлялися. Яке ж було здивування, коли штучно введенісинтетичні аналоги киРНК викликали сильний специфічний дозозалежний ефект у культурах клітин ссавців! Це означало, що у клітинах хребетних РНК-інтерференція не замінилася складнішими системами імунітету, а еволюціонувала разом із організмами, перетворившись на щось «просунуте». Отже, у ссавців треба було шукати не точні аналоги кіРНК, які еволюційних наступників.

Гравець №2 - мікроРНК

Дійсно, на основі еволюційно досить давнього механізму РНК-інтерференції у більш розвинених організмів з'явилися дві спеціалізовані системи управління роботою генів, які використовують кожна свою групу малих РНК. мікроРНК(microRNA) та піРНК(piRNA, Piwi-interacting RNA). Обидві системи з'явилися ще у губок і кишковопорожнинних і еволюціонували разом з ними, витіснивши кіРНК та механізм голої РНК-інтерференції. Їх роль забезпеченні імунітету знижується, оскільки цю функцію взяли він досконаліші механізми клітинного імунітету, - зокрема, интерфероновая система . Однак ця система настільки чутлива, що спрацьовує і на саму кіРНК: поява в клітині ссавців малих дволанцюжкових РНК запускає «сигнал тривоги» (активує секрецію інтерферону і викликає експресію інтерферон-залежних генів, що блокує всі процеси трансляції повністю). У зв'язку з цим механізм РНК-інтерференції у вищих тварин опосередкований в основному мікроРНК та піРНК - одноланцюжковими молекулами зі специфічною структурою, яка не виявляється інтерфероновою системою.

У міру ускладнення геному мікроРНК та піРНК брали все більшу участь у регуляції транскрипції та трансляції. Згодом, вони перетворилися на додаткову, точну та тонку систему регуляції геному. На відміну від кіРНК, мікроРНК та піРНК (відкриті в 2001 році, див. врізання 3) не виробляються з чужорідних дволанцюгових молекул РНК, а спочатку закодовані в геномі організму-господаря.

Зустрічайте: мікроРНК

Попередник мікроРНК транскрибується з обох ланцюгів геномної ДНК РНК-полімеразою II, в результаті чого з'являється проміжна форма - при-мікроРНК, - несучі ознаки звичайної мРНК - m 7 G-кеп і поліА-хвіст. У цьому попереднику утворюється петля з двома одноланцюжковими «хвостами» та кількома неспареними нуклеотидами у центрі (рис. 3). Така петля піддається двостадійному процесингу (рис. 4): спочатку ендонуклеаза Drosha відрізає від шпильки одноланцюгові «хвости» РНК, після чого вирізана шпилька (пре-мікроРНК) експортується в цитоплазму, де впізнається два рази , позначений кольором на рис.3). У такому вигляді зріла мікроРНК, аналогічно киРНК, входить до складу комплексу RISC.

Малюнок 3. Структура дволанцюгової молекули-попередника мікроРНК.Основні особливості: наявність консервативних послідовностей, що формують шпильку; наявність комплементарної копії (мікроРНК*) із двома «зайвими» нуклеотидами на 3′-кінці; специфічна послідовність (2-8 п. н.), що формує сайт впізнавання для ендонуклеаз. Сама мікроРНК виділена червоним кольором – саме її і вирізає Dicer.

Механізм дії багатьох мікроРНК аналогічний до дії киРНК: коротка (21–25 нуклеотидів) одноланцюжкова РНК у складі білкового комплексу RISC з високою специфічністю зв'язується з комплементарною ділянкою в 3′-нетрансльованій області мРНК-мішені. Зв'язування призводить до розщеплення мРНК Ago білком. Однак активність мікроРНК (порівняно з кіРНК) вже більш диференційована - якщо комплементарність не абсолютна, цільова мРНК може не деградувати, а лише оборотно блокуватись (трансляції не буде). Той самий RISC-комплекс може використовувати і штучно введенікіРНК. Це пояснює, чому кіРНК, зроблені за аналогією з найпростішими, активні і у ссавців.

Таким чином, ми можемо доповнити ілюстрацію механізму дії РНК-інтерференції у вищих (білатерально-симетричних) організмів, об'єднавши на одному малюнку схему дії мікроРНК та біотехнологічно введених кіРНК (рис. 5).

Рисунок 5. Узагальнена схема дії штучних мікроРНК та кіРНК(штучні кіРНК вводяться в клітину за допомогою спеціалізованих плазмід - targeting siRNA vector).

Функції мікроРНК

Фізіологічні функції микроРНК дуже різноманітні - власне, вони виступають основними небілковими регуляторами онтогенезу. мікроРНК не скасовують, а доповнюють «класичну» схему регулювання генів (індуктори, супресори, компактизація хроматину і т. д.). Крім того, синтез самих мікроРНК складно регулюються (певні пули мікроРНК можуть включатися інтерферонами, інтерлейкінами, фактором некрозу пухлин α (ФНП-α) та багатьма іншими цитокінами). В результаті вимальовується приголомшлива за своєю складністю та гнучкістю багаторівнева мережа налаштування «оркестру» з тисяч генів, але й цим справа не закінчується.

мікроРНК більш «універсальні», ніж кіРНК: «підопічні» гени не обов'язково мають бути на 100% комплементарні – регуляція здійснюється і за часткової взаємодії. На сьогодні одна з найгарячіших тем у молекулярній біології – пошук мікроРНК, які виступають альтернативними регуляторами відомих фізіологічних процесів. Наприклад, вже описані мікроРНК, що беруть участь у регуляції клітинного циклу та апоптозу у рослин, дрозофіли та нематоди; у людини мікроРНК регулюють імунну систему та розвиток гематопоетичних стовбурових клітин. Застосування технологій на основі біочіпів (micro-array screening) показало, що на різних етапах життя клітин включаються та вимикаються цілі пули малих РНК. Для біологічних процесів ідентифікували десятки специфічних мікроРНК, рівень експресії яких у певних умовах змінюється у тисячі разів, підкреслюючи виняткову керованість цих процесів.

До недавнього часу вважалося, що мікроРНК лише пригнічують – повністю чи частково – роботу генів. Однак нещодавно виявилося: дія мікроРНК може кардинально відрізнятись залежно від стану клітини! В клітині мікроРНК, що активно ділиться, зв'язавшись з комплементарною послідовністю в 3'-ділянці мРНК, інгібує синтез білка (трансляцію). Однак у стані спокою або стресу (наприклад, при зростанні на бідному середовищі) та сама подія призводить до прямо протилежного ефекту - посилення синтезу цільового білка !

Еволюція мікроРНК

Кількість різновидів мікроРНК у вищих організмів ще до кінця не встановлено - за деякими даними, воно перевищує 1% від числа генів, що кодують білок (у людини, наприклад, говорять про 700 мікроРНК, і це число постійно зростає). мікроРНК регулюють активність близько 30% всіх генів (мішені для багатьох з них поки не відомі), причому існують як повсюдно поширені, так і тканеспецифічні молекули - наприклад, один такий важливий пул мікроРНК регулює дозрівання стовбурових клітин крові.

Широкий профіль експресії в різних тканинах різних організмів та біологічна поширеність мікроРНК говорить про еволюційно давнє походження. Вперше мікроРНК виявили у нематод, і довгий час потім вважали, що ці молекули з'являються лише у губок та кишковопорожнинних; проте пізніше їх відкрили і в одноклітинних водоростях. Цікаво, що з ускладненням організмів збільшується також кількість і гетерогенність пулу мікроРНК. Це побічно свідчить у тому, що складність цих організмів забезпечується, зокрема, функціонуванням микроРНК . Можлива еволюція мікроРНК показано малюнку 6.

Малюнок 6. Розмаїття мікроРНК у різних організмів.Що організація організму, то більше в нього виявляється микроРНК (число в дужках). Червоним виділено види, у яких виявлено одиничнімікроРНК.

Між кіРНК та мікроРНК можна провести чіткий еволюційний зв'язок, спираючись на такі факти:

дія обох видів взаємозамінна та опосередковується гомологічними білками;
киРНК, введені у клітини ссавців, специфічно «вимикають» необхідні гени (попри деяку активацію інтерферонового захисту);
мікроРНК виявляються у дедалі більше древніх організмів.

Ці та інші дані дозволяють припустити походження обох систем від загального предка. Цікаво також відзначити, що «РНКовий» імунітет як незалежний попередник білкових антитіл підтверджує теорію зародження перших форм життя на основі РНК, а не білків (нагадаємо, що це улюблена теорія академіка А. С. Спіріна).

Чим далі, тим заплутаніше. Гравець №3 - піРНК

Поки що на арені молекулярної біології було лише два «гравці» – кіРНК та мікроРНК – основне «призначення» РНК-інтерференції здавалося цілком зрозумілим. Дійсно: набір гомологічних коротких РНК та білків у різних організмів здійснює аналогічні дії; принаймні ускладнення організмів ускладнюється і функціональність.

Однак у процесі еволюції природа створила ще одну, еволюційно пізню і вузькоспеціалізовану систему на основі все того ж вдалого принципу РНК-інтерференції. Йдеться піРНК (piRNA Piwi-interaction RNA).

Чим складніше організований геном, тим більше розвинений та пристосований організм (або навпаки? ;-). Однак збільшення складності геному має і зворотний бік: складна генетична система стає нестабільною. Це веде до необхідності механізмів, відповідальних підтримку цілісності геному - інакше мимовільне «перемішування» ДНК просто виведе її з ладу. Мобільні генетичні елементи ( МГЕ) - один з основних факторів нестабільності геному - являють собою короткі нестабільні ділянки, які можуть автономно транскрибуватися та мігрувати по геному. Активація таких мобільних елементів призводить до множинних розривів ДНК у хромосомах, що загрожують летальними наслідками.

Кількість МГЕ нелінійно збільшується з розміром геному, та їхню активність необхідно стримувати. Для цього тварини, вже починаючи з кишковопорожнинних, використовують той самий феномен РНК-інтерференції. Цю функцію також виконують короткі РНК, проте не ті, про які вже йшлося, а третій їх тип - піРНК.

"Портрет" піРНК

Функції піРНК

Головна функція піРНК – пригнічення активності МГЕ на рівні транскрипції та трансляції. Вважається, що піРНК активні лише під час ембріогенезу, коли непередбачувані перетасовування геному особливо небезпечні та можуть призвести до загибелі зародка. Це логічно - коли імунна система ще не запрацювала, клітини ембріона потребують якогось простого, але дієвого захисту. Від зовнішніх патогенів ембріон надійно захищений плацентою (або оболонкою яйця). Але, крім цього, необхідна оборона і від ендогенних (внутрішніх) вірусів, - насамперед МГЕ.

Ця роль піРНК підтверджена досвідом – «нокаут» або мутації генів Ago3, Piwi або Aub призводять до серйозних порушень розвитку (і різкого збільшення числа мутацій у геномі такого організму), а також викликають безплідність за рахунок порушення розвитку статевих клітин.

Поширення та еволюція піРНК

Перші піРНК виявляються вже в актиній та губок. Рослини, мабуть, пішли іншим шляхом – білки Piwi у них не виявлені, а роль «намордника» для транспозонів виконують ендонуклеазу Ago4 та кіРНК.

У вищих тварин - у тому числі й людини - система піРНК розвинена дуже добре, але зустріти її можна тільки в ембріональних клітинах та навколоплідному ендотелії. Чому розповсюдження піРНК в організмі настільки обмежене - ще доведеться дізнатися. Можна припустити, що, як і будь-яка потужна зброя, піРНК приносить користь тільки в дуже специфічних умовах (під час розвитку плоду), а в дорослому організмі їхня активність завдасть більше шкоди, ніж користі. Проте, число піРНК значно перевищує кількість відомих білків - і неспецифічні ефекти піРНК у зрілих клітинах складно передбачити.

Таблиця 1. Властивості всіх трьох класів коротких РНК

	кіРНК	мікроРНК	піРНК
Розповсюдження	Рослини, Drosophila, C. elegans. Не знайдено у хребетних	Еукаріоти	Ембріональні клітини тварин (починаючи з кишковопорожнинних). Немає у найпростіших рослин
Довжина	21-22 нуклеотидів	19-25 нуклеотидів	24–30 нуклеотидів
Структура	Дволанцюжкова, по 19 комплементарних нуклеотидів і два неспарені нуклеотиди на 3′-кінці	Одноланцюжкова складна структура	Одноланцюжкова складна структура. U на 5′-кінці, 2′- O-метильований 3′-кінець
Процесинг	Dicer-залежний	Dicer-залежний	Dicer-незалежний
Ендонуклеази	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Активність	Деградація комплементарних мРНК, ацетилювання геномної ДНК	Деградація чи інгібування трансляції цільової мРНК	Деградація мРНК, що кодують МГЕ, регулювання транскрипції МГЕ
Біологічна роль	Антивірусний імунний захист, пригнічення активності власних генів	Регуляція активності генів	Пригнічення активності МГЕ під час ембріогенезу

Висновок

На закінчення хочеться навести таблицю, що ілюструє еволюцію білкового апарату, що у РНК-интерференции (рис. 9). Видно, що у найпростіших найбільш розвинена система кіРНК (білкові сімейства Ago, Dicer), а з ускладненням організмів акцент переноситься на більш спеціалізовані системи - збільшується кількість білків ізоформ для мікроРНК (Drosha, Pasha) і піРНК (Piwi, Hen1). При цьому різноманітність ферментів, що опосередковують дію кіРНК, зменшується.

Малюнок 9. Різноманітність білків, що у РНК-интерференции(Цифри позначають кількість білків кожної групи). Синім кольоромпідсвічені елементи, характерні для кіРНК та мікроРНК, а червоним- білк іпов'язані з піРНК.

Явище РНК-інтерференції почали використовувати найпростіші організми. На основі цього механізму природа створила прототип імунної системи, а з ускладненням організмів РНК-інтерференція стає незамінним регулятором активності геному. Два різні механізми плюс три види коротких РНК ( див.таб. 1) – в результаті ми бачимо тисячі тонких регуляторів різних метаболічних та генетичних шляхів. Ця разюча картина ілюструє універсальність та еволюційну адаптацію молекулярних біологічних систем. Короткі РНК знову доводять, що «дрібниць» усередині клітини немає - є лише дрібні молекули, всю роль ролі яких ми тільки починаємо розуміти.

(Щоправда, така фантастична складність свідчить швидше про те, що еволюція «сліпа» і діє без наперед затвердженого «генерального плану»»;

Andrew Grimson, Mansi Srivastava, Bryony Fahey, Ben J. Woodcroft, H. Rosaria Chiang, et. al.. (2008). Найперші origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals . Nature. 455 , 1193-1197;

A. A. Aravin, G. J. Hannon, J. Brennecke. (2007). The Piwi-piRNA Pathway забезпечує Adaptive Defense в Transposon Arms Race . Science. 318 , 761-764;

Метафора, що лежить в основі назви явища РНК-інтерференції, відсилає до досвіду з петунією, коли штучно введені в рослину гени синтетази рожевого та фіолетового пігментів не збільшили інтенсивність забарвлення, а навпаки, зменшили її. Аналогічно, у «звичайній» інтерференції накладання двох хвиль може призводити до взаємного «гасіння».

У живій клітині потік інформації між ядром і цитоплазмою ніколи не вичерпується, проте розуміння всіх його «завихрень» та розшифрування закодованої у ньому інформації – воістину титанічна задача. Одним із найважливіших ривків у біології минулого століття можна вважати відкриття молекул інформаційних (або матричних) РНК (іРНК або мРНК), які є посередниками, які переносять інформаційні «повідомлення» з ядра (з хромосом) в цитоплазму. Визначальна роль РНК у синтезі білків була передбачена ще 1939 року у роботі Торбьорна Касперссона (Torbjörn Caspersson), Жана Брачета (Jean Brachet) і Джека Шульца (Jack Schultz), а 1971 року Джордж Марбайс (George Marbas) жаби, зробивши ін'єкцію вперше виділеної матричної РНК кролика, що кодує цей білок.

У 1956-57 роках у Радянському Союзі А. Н. Білозерський та А. С. Спірін незалежно довели існування мРНК, а також з'ясували, що основну масу РНК у клітині становить зовсім не матрична, а рибосомальна РНК (рРНК). Рибосомальна РНК – другий «головний» вид клітинної РНК – утворює «скелет» та функціональний центр рибосом у всіх організмів; саме рРНК (а чи не білки) регулює основні етапи білкового синтезу. Одночасно було описано та вивчено і третій «головний» вид РНК – транспортні РНК (тРНК), які у комплексі з двома іншими – мРНК та рРНК – формують єдиний білок-синтезуючий комплекс. Згідно з досить популярною гіпотезою «світу РНК», саме ця нуклеїнова кислота лежала біля витоків життя на Землі.

У зв'язку з тим, що РНК значно більш гідрофільна порівняно з ДНК (за рахунок заміни дезоксирибози на рибозу), вона більш лабільна і може відносно вільно переміщатися в клітині, а значить і доставляти короткоживучі репліки генетичної інформації (мРНК) до місця, де починається білковий синтез. Однак варто відзначити і пов'язане з цим «незручність» – РНК дуже нестабільна. Вона набагато гірша, ніж ДНК, зберігається (навіть усередині клітини) і деградує за найменшої зміни умов (температура, рН). Крім «власної» нестабільності, великий внесок належить рибонуклеазам (або РНКазам) – класу ферментів, що розщеплюють РНК, дуже стабільних і «всюдисущих» – навіть шкіра рук експериментатора містить достатню кількість цих ферментів, щоб перекреслити весь експеримент. Через це працювати з РНК набагато складніше, ніж із білками чи ДНК – остання взагалі може зберігатися сотні тисяч років практично без пошкоджень.

Фантастична акуратність при роботі, тридистилят, стерильні рукавички, одноразовий лабораторний посуд – все це необхідно для запобігання деградації РНК, проте дотримання таких стандартів не завжди було можливим. Тому довгий час на короткі «уламки» РНК, які неминуче забруднювали розчини, просто не звертали уваги. Однак згодом стало ясно, що, незважаючи на всі зусилля щодо підтримки стерильності робочої області, «уламки» закономірно продовжували виявлятися, а потім з'ясувалося, що в цитоплазмі завжди присутні тисячі коротких дволанцюжкових РНК, які виконують певні функції, і абсолютно необхідні для нормального розвитку клітини та організму.

Принцип РНК-інтерференції

Сьогодні вивчення малих регуляторних РНК є однією з областей молекулярної біології, що найбільш бурхливо розвиваються. Виявлено, що всі короткі РНК виконують свої функції на основі явища, названого РНК-інтерференцією (суть цього феномена полягає у придушенні експресії гена на стадії транскрипції або трансляції за участю малих молекул РНК). Дуже схематично механізм РНК-інтерференції показано на рис.1:

Мал. 1. Основи РНК-інтерференції
Дволанцюгові молекули РНК (дцРНК) нехарактерні для нормальних клітин, але є обов'язковим етапом життєвого циклу багатьох вірусів. Спеціальний білок Dicer, виявивши в клітці дцРНК, ріже її на невеликі фрагменти. Антизмістовий ланцюг такого фрагмента, який вже можна називати короткою РНК, що інтерферує (кіРНК, від siRNA – small interference RNA), зв'язується комплексом білків під назвою RISC (RNA-induced silencing complex), центральний елемент якого – ендонуклеаза сімейства Argonaute. Зв'язування з кіРНК активує RISC і запускає у клітині пошук молекул ДНК та РНК, комплементарних «шаблонній» кіРНК. Доля таких молекул – бути знищеними чи інактивованими комплексом RISC.

Підсумовуючи, короткі «обрізки» чужорідної (у тому числі, введеної навмисно) дволанцюжкової РНК служать «шаблоном» для широкомасштабного пошуку та знищення комплементарних мРНК (а це еквівалентно придушенню експресії відповідного гена), – причому, не тільки в одному і не тільки сусідніх. Для багатьох організмів – найпростіших, молюсків, хробаків, комах, рослин – цей феномен є одним із основних способів імунного захисту проти інфекцій.

У 2006 році Ендрю Файєр (Andrew Fire) та Крейг Мелло (Craig Mello) одержують Нобелівську премію з фізіології та медицини «За відкриття явища РНК-інтерференції – механізму сайленсингу генів за участю дцРНК». Хоча сам феномен РНК-інтерференції був описаний задовго до того (ще на початку 1980-х), саме роботи Файєра і Мелло загалом визначили регуляторний механізм малих РНК і окреслили невідому до того часу область молекулярних досліджень. Ось основні результати їх робіт:

При РНК-інтерференції розщеплюється саме мРНК (і жодна інша);
Дволанцюжкова РНК діє (викликає розщеплення) значно ефективніше одноланцюгової. Ці два спостереження пророкували існування спеціалізованої системи, що опосередковує дію дцРНК;
дцРНК, комплементарна ділянці зрілої мРНК, викликає розщеплення останньої. Це вказувало на цитоплазматичну локалізацію процесу та наявність специфічної ендонуклеази;
Невеликої кількості дцРНК (кілька молекул на клітину) достатньо для повного «вимкнення» цільового гена, що вказує на існування каскадного механізму каталізу та/або ампліфікації.

Ці результати заклали фундамент цілого напрямку сучасної молекулярної біології – РНК-інтерференції – та визначили вектор роботи безлічі дослідницьких груп у всьому світі не на один десяток років. Наразі виявлено три великі групи малих РНК, які грають на молекулярному полі за «команду РНК-інтерференції». Познайомимося з ними детальніше.

Гравець № 1 – короткі інтерферуючі РНК

Специфічність РНК-інтерференції визначається короткими інтерферуючими РНК (кіРНК) – невеликими дволанцюжковими молекулами РНК із чітко визначеною структурою (див. рис.2).

киРНК еволюційно найбільш ранні, і поширені найширше у рослин, одноклітинних організмів та безхребетних. У хребетних у нормі киРНК практично не виявлено, тому що їх витіснили пізніші «моделі» коротких РНК (див. далі).

кіРНК – «шаблони» для пошуку в цитоплазмі та знищення молекул мРНК – мають довжину 20–25 нуклеотидів та «особливу прикмету»: по 2 неспарені нуклеотиди на 3'-кінцях і фосфорильовані 5'-кінці. Анти-смислова кіРНК здатна (не сама, звичайно, а за допомогою RISC-комплексу) розпізнавати мРНК і специфічно викликати її деградацію: розріз цільової мРНК завжди відбувається точно в місці, комплементарному 10 і 11 нуклеотидів антисмислового ланцюга кіРНК.

Мал. 2. Механізм «інтерференції» мРНК та кіРНК
"Інтерферуючі" короткі молекули РНК можуть як потрапляти в клітину ззовні, так і "нарізатися" вже на місці з довших дволанцюгових РНК. Основний білок, необхідний для "нарізування" дцРНК, – ендонуклеаза Dicer. «Вимкнення» гена за механізмом інтерференції здійснюється кіРНК спільно з білковим комплексом RISC, який складається з трьох білків – ендонуклеази Ago2 та двох допоміжних білків PACT та TRBP. Пізніше було виявлено, що комплекси Dicer і RISC можуть використовувати як «затравку» не тільки дцРНК, а й одноланцюжкову РНК, що формує дволанцюжкову шпильку, а також готову кіРНК (остання мине стадію «нарізання» і відразу зв'язується з RISC).

Функції киРНК у клітинах безхребетних досить різноманітні. Перша та основна – це імунний захист. «Традиційна» імунна система (лімфоцити + лейкоцити + макрофаги) є лише у складних багатоклітинних організмів. У одноклітинних, безхребетних і рослин (у яких такої системи або немає, або вона знаходиться в зародковому стані) імунний захист будується на основі РНК-інтерференції. Імунітет, заснований на РНК-інтерференції, не потребує складних органів «тренування» попередників імунних клітин (селезінка, тимус); в той же час, різноманіття теоретично можливих послідовностей коротких РНК (421 варіантів) співвідносне з числом можливих антитіл білкових вищих тварин. Крім того, кіРНК синтезуються на основі інфікованої клітини «ворожої» РНК, а значить, на відміну від антитіл, вони відразу «заточуються» під конкретний тип інфекції. І хоча поза клітиною захист на основі РНК-інтерференції не працює (принаймні таких даних поки немає), внутрішньоклітинний імунітет вона забезпечує більш ніж задовільно.

Насамперед, кіРНК створює антивірусний імунітет, знищуючи мРНК або геномну РНК інфекційних організмів (наприклад, кіРНК і були відкриті у рослин). Введення вірусної РНК викликає потужну ампліфікацію специфічних кіРНК на основі молекули-затравки - самої вірусної РНК. Крім того, кіРНК пригнічують експресію різних мобільних генетичних елементів (МГЕ), а отже забезпечує захист і від ендогенних «інфекцій». Мутації в генах RISC-комплексу часто ведуть до підвищення нестабільності геному через високу активність МГЕ; киРНК може бути обмежувачем експресії власних генів, спрацьовуючи у відповідь їх гіперекспресію. Регуляція роботи генів може відбуватися як на рівні трансляції, а й під час транскрипції – через метилювання генів по гістону Н3.

У сучасній експериментальній біології значення РНК-інтерференції та коротких РНК важко переоцінити. Розроблено технологію «вимкнення» (або нокдауну) окремих генів in vitro (на культурах клітин) та in vivo (на ембріонах), що вже стало стандартом de facto щодо будь-якого гена. Іноді навіть, щоб встановити роль окремих генів у якомусь процесі, проводять систематичне «вимикання» всіх генів по черзі.

Можливістю застосування киРНК зацікавилися і фармацевти, оскільки здатність спрямованої регуляції роботи окремих генів обіцяє нечувані перспективи лікування маси захворювань. Невеликий розмір та висока специфічність дії обіцяють високу ефективність та низьку токсичність ліків на основі кіРНК; Однак вирішити проблему доставки киРНК до хворих клітин в організмі поки не вдалося - виною тому крихкість і недовговічність цих молекул. І хоча зараз десятки колективів намагаються знайти спосіб спрямовувати ці «чарівні кулі» точно в ціль (всередину хворих органів), видимих успіхів вони поки що не досягли. Окрім цього, є й інші складнощі. Наприклад, у разі антивірусної терапії висока вибірковість дії кіРНК може надати «ведмежу послугу» – оскільки віруси швидко мутують, змінений штам дуже швидко втратить чутливість до кіРНК, підібраної на початку терапії: відомо, що заміна лише одного нуклеотиду в кіРНК призводить до суттєвого зниження ефект інтерференції.

У цьому місці варто нагадати ще раз – кіРНК були виявлені лише у рослин, безхребетних та одноклітинних; хоча гомологи білків для РНК-інтерференції (Dicer, RISC-комплекс) є і у вищих тварин, киРНК звичними методами не виявлялися. Яке ж було здивування, коли штучно запроваджені синтетичні аналоги кіРНК викликали сильний специфічний дозозалежний ефект у культурах клітин ссавців! Це означало, що у клітинах хребетних РНК-інтерференція не замінилася складнішими системами імунітету, а еволюціонувала разом із організмами, перетворившись на щось «просунуте». Отже, у ссавців треба було шукати не точні аналоги кіРНК, які еволюційних наступників.

Гравець № 2 – мікроРНК

Справді, з урахуванням еволюційно досить древнього механізму РНК-интерференции у найрозвиненіших організмів з'явилися дві спеціалізовані системи управління роботою генів, використовують кожна свою групу малих РНК – микроРНК (microRNA) і пиРНК (piRNA, Piwi-interacting RNA). Обидві системи з'явилися ще у губок і кишковопорожнинних і еволюціонували разом з ними, витіснивши кіРНК та механізм голої РНК-інтерференції. Їхня роль у забезпеченні імунітету знижується, оскільки цю функцію взяли на себе досконаліші механізми клітинного імунітету, – зокрема, інтерферонова система. Однак ця система настільки чутлива, що спрацьовує і на саму кіРНК: поява в клітині ссавців малих дволанцюжкових РНК запускає «сигнал тривоги» (активує секрецію інтерферону і викликає експресію інтерферон-залежних генів, що блокує всі процеси трансляції повністю). У зв'язку з цим механізм РНК-інтерференції у вищих тварин опосередкований в основному мікроРНК та піРНК – одноланцюжковими молекулами зі специфічною структурою, яка не виявляється інтерфероновою системою.

У міру ускладнення геному мікроРНК та піРНК брали все більшу участь у регуляції транскрипції та трансляції. Згодом, вони перетворилися на додаткову, точну та тонку систему регуляції геному. На відміну від кіРНК, мікроРНК та піРНК (відкриті у 2001 році, див. рис.3, А-В) не виробляються з чужорідних дволанцюжкових молекул РНК, а спочатку закодовані в геномі організму-господаря.

Попередник мікроРНК транскрибується з обох ланцюгів геномної ДНК РНК-полімеразою II, внаслідок чого з'являється проміжна форма – при-мікроРНК, – несуча ознаки звичайної мРНК – m7G-кеп та поліА-хвіст. У цьому попереднику утворюється петля з двома одноланцюжковими «хвостами» та кількома неспареними нуклеотидами у центрі (рис. 3А). Така петля піддається двостадійному процесингу (рис. Б): спочатку ендонуклеаза Drosha відрізає від шпильки одноланцюгові «хвости» РНК, після чого вирізана шпилька (пре-мікроРНК) експортується в цитоплазму, де впізнається Dicer'ом, в , позначений кольором (рис. 3А). У такому вигляді зріла мікроРНК, аналогічно киРНК, входить до складу комплексу RISC.

Механізм дії багатьох мікроРНК аналогічний до дії киРНК: коротка (21–25 нуклеотидів) одноланцюжкова РНК у складі білкового комплексу RISC з високою специфічністю зв'язується з комплементарною ділянкою в 3'-нетрансльованій області мРНК-мішені. Зв'язування призводить до розщеплення мРНК Ago білком. Однак активність мікроРНК (порівняно з кіРНК) вже більш диференційована – якщо комплементарність не абсолютна, цільова мРНК може не деградувати, а лише оборотно блокуватись (трансляції не буде). Той самий RISC-комплекс може використовувати і штучно введені кіРНК. Це пояснює, чому кіРНК, зроблені за аналогією з найпростішими, активні і у ссавців.

Таким чином, ми можемо доповнити ілюстрацію механізму дії РНК-інтерференції у вищих (білатерально-симетричних) організмів, поєднавши на одному малюнку схему дії мікроРНК та біотехнологічно введених кіРНК (рис. 3В).

Мал. 3А: Структура дволанцюгової молекули-попередника мікроРНК
Основні особливості: наявність консервативних послідовностей, що формують шпильку; наявність комплементарної копії (мікроРНК*) із двома «зайвими» нуклеотидами на 3'-кінці; специфічна послідовність (2-8 п. н.), що формує сайт впізнавання для ендонуклеаз. Сама мікроРНК виділена червоним кольором – саме її вирізає Dicer.

Мал. 3Б: Загальний механізм процесингу мікроРНК та її активності

Мал. 3В: Узагальнена схема дії штучних мікроРНК та кіРНК
Штучні кіРНК вводяться в клітину за допомогою спеціалізованих плазмід (targeting siRNA vector).

Функції мікроРНК

Фізіологічні функції микроРНК дуже різноманітні – власне, вони виступають основними небілковими регуляторами онтогенезу. мікроРНК не скасовують, а доповнюють «класичну» схему регулювання генів (індуктори, супресори, компактизація хроматину і т. д.). Крім того, синтез самих мікроРНК складно регулюються (певні пули мікроРНК можуть включатися інтерферонами, інтерлейкінами, фактором некрозу пухлин α (ФНП-α) та багатьма іншими цитокінами). В результаті вимальовується приголомшлива за своєю складністю та гнучкістю багаторівнева мережа налаштування «оркестру» з тисяч генів, але й цим справа не закінчується.

мікроРНК «універсальніші», ніж кіРНК: «підопічні» гени не обов'язково повинні бути на 100% комплементарні – регуляція здійснюється і при частковій взаємодії. На сьогодні одна з найгарячіших тем у молекулярній біології – пошук мікроРНК, які є альтернативними регуляторами відомих фізіологічних процесів. Наприклад, вже описані мікроРНК, що беруть участь у регуляції клітинного циклу та апоптозу у рослин, дрозофіли та нематоди; у людини мікроРНК регулюють імунну систему та розвиток гематопоетичних стовбурових клітин. Застосування технологій на основі біочіпів (micro-array screening) показало, що на різних етапах життя клітин включаються та вимикаються цілі пули малих РНК. Для біологічних процесів ідентифікували десятки специфічних мікроРНК, рівень експресії яких у певних умовах змінюється у тисячі разів, підкреслюючи виняткову керованість цих процесів.

Донедавна вважалося, що микроРНК лише пригнічують – повністю чи частково – роботу генів. Однак нещодавно виявилося: дія мікроРНК може кардинально відрізнятись залежно від стану клітини! В клітині мікроРНК, що активно ділиться, зв'язавшись з комплементарною послідовністю в 3'-ділянці мРНК, інгібує синтез білка (трансляцію). Однак у стані спокою або стресу (наприклад, при зростанні на бідному середовищі) та сама подія призводить до прямо протилежного ефекту – посилення синтезу цільового білка!

Еволюція мікроРНК

Мал. 4. Різноманітність мікроРНК у різних організмів
Що організація організму, то більше в нього виявляється микроРНК (число в дужках). Червоним виділено види, у яких виявлені поодинокі мікроРНК. За даними .

Між кіРНК та мікроРНК можна провести чіткий еволюційний зв'язок, спираючись на такі факти:

дія обох видів взаємозамінна та опосередковується гомологічними білками;
киРНК, введені у клітини ссавців, специфічно «вимикають» необхідні гени (попри деяку активацію інтерферонового захисту);
мікроРНК виявляються у дедалі більше древніх організмів.

Чим складніше організований геном, тим більше розвинений та пристосований організм (або навпаки? ;-). Однак збільшення складності геному має і зворотний бік: складна генетична система стає нестабільною. Це призводить до необхідності механізмів, відповідальних підтримку цілісності геному – інакше мимовільне «перемішування» ДНК просто виведе її з ладу. Мобільні генетичні елементи (МГЕ) – один з основних факторів нестабільності геному – є короткими нестабільними ділянками, які можуть автономно транскрибуватися та мігрувати за геномом. Активація таких мобільних елементів призводить до множинних розривів ДНК у хромосомах, що загрожують летальними наслідками.

"Портрет" піРНК

піРНК - короткі молекули завдовжки 24-30 нуклеотидів, закодовані в центромірних і тіломірних областях хромосоми. Послідовності багатьох з них комплементарні відомим мобільним генетичним елементам, проте є безліч інших піРНК, що збігаються з ділянками робочих генів або фрагментами геному, функції яких невідомі.

піРНК (як і мікроРНК) закодовані в обох ланцюгах геномної ДНК; вони дуже мінливі та різноманітні (до 500 000 (!) видів в одному організмі). На відміну від кіРНК та мікроРНК, вони утворюються одним ланцюгом з характерною особливістю – урацилом (U) на 5'-кінці та метильованим 3'-кінцем. Є й інші відмінності:

На відміну від кіРНК та мікроРНК, вони не вимагають процесингу Dicer'ом;
Гени піРНК активні тільки в зародкових клітинах (під час ембріогенезу) і навколишніх ендотеліальних клітинах;
Білковий склад системи піРНК інший - це ендонуклеази класу Piwi (Piwi і Aub) і окремий різновид Argonaute - Ago3.

Процесинг та активність піРНК поки що досить погано вивчені, але вже ясно, що механізм дії зовсім відрізняється від інших коротких РНК – сьогодні запропоновано пінг-понг модель їхньої роботи (рис.5 А, Б).

Пінг-понг механізм біогенезу піРНК

Мал. 5А: Цитоплазматична частина процесингу піРНК
Біогенез та активність піРНК опосередковується сімейством ендонуклеаз Piwi (Ago3, Aub, Piwi). Активність піРНК забезпечується обома одноланцюжковими молекулами піРНК – смислової та антисмислової, – кожна з яких асоціює зі специфічною ендонуклеазою Piwi. піРНК дізнається комплементарну ділянку мРНК транспозону (синій ланцюг) та вирізає його. Це не тільки інактивує транспозон, а й створює нову піРНК (пов'язану з Ago3 за допомогою метилювання метилазою Hen1 3'-кінця). Така пиРНК, своєю чергою, дізнається мРНК з транскриптами кластера попередників пиРНК (червона ланцюг) – у такий спосіб цикл замикається і знову виробляється потрібна пиРНК .

Мал. 5Б: піРНК у ядрі
Крім ендонуклеази Aub, антисмислову піРНК може пов'язувати і ендонуклеазу Piwi. Після зв'язування комплекс мігрує в ядро, де викликає деградацію комплементарних транскриптів та перебудову хроматину, що викликає пригнічення активності транспозонів.

Функції піРНК

Головна функція піРНК - пригнічення активності МГЕ на рівні транскрипції та трансляції. Вважається, що піРНК активні лише під час ембріогенезу, коли непередбачувані перетасовування геному особливо небезпечні та можуть призвести до загибелі зародка. Це логічно – коли імунна система ще не запрацювала, клітини ембріона потребують якогось простого, але дієвого захисту. Від зовнішніх патогенів ембріон надійно захищений плацентою (або оболонкою яйця). Але, крім цього, необхідна оборона і від ендогенних (внутрішніх) вірусів, – насамперед МГЕ.

Поширення та еволюція піРНК

У вищих тварин - у тому числі й людини - система піРНК розвинена дуже добре, але зустріти її можна тільки в ембріональних клітинах і навколоплідному ендотелії. Чому поширення піРНК в організмі настільки обмежене - ще доведеться дізнатися. Можна припустити, що, як і будь-яка потужна зброя, піРНК приносить користь тільки в дуже специфічних умовах (під час розвитку плоду), а в дорослому організмі їхня активність завдасть більше шкоди, ніж користі. Проте, кількість піРНК значно перевищує кількість відомих білків – і неспецифічні ефекти піРНК у зрілих клітинах складно передбачити.

Зведена таблиця. Властивості всіх трьох класів коротких РНК

	кіРНК	мікроРНК	піРНК
Розповсюдження	Рослини, Drosophila, C. elegans. Не знайдено у хребетних	Еукаріоти	Ембріональні клітини тварин (починаючи з кишковопорожнинних). Немає у найпростіших рослин
Довжина	21-22 нуклеотидів	19-25 нуклеотидів	24-30 нуклеотидів
Структура	Дволанцюжкова, по 19 комплементарних нуклеотидів і два неспарені нуклеотиди на 3'-кінці	Одноланцюжкова складна структура	Одноланцюжкова складна структура. U на 5'-кінці, 2'- O-метильований 3'-кінець
Процесинг	Dicer-залежний	Dicer-залежний	Dicer-незалежний
Ендонуклеази	Ago2	Ago1, Ago2	Ago3, Piwi, Aub
Активність	Деградація комплементарних мРНК, ацетилювання геномної ДНК	Деградація чи інгібування трансляції цільової мРНК	Деградація мРНК, що кодують МГЕ, регулювання транскрипції МГЕ
Біологічна роль	Антивірусний імунний захист, пригнічення активності власних генів	Регуляція активності генів	Пригнічення активності МГЕ під час ембріогенезу

Висновок

На закінчення хочеться навести таблицю, що ілюструє еволюцію білкового апарату, що у РНК-интерференции (рис.6). Видно, що у найпростіших найбільш розвинена система кіРНК (білкові сімейства Ago, Dicer), а з ускладненням організмів акцент переноситься на більш спеціалізовані системи – збільшується кількість білків ізоформ для мікроРНК (Drosha, Pasha) і піРНК (Piwi, Hen1). При цьому різноманітність ферментів, що опосередковують дію кіРНК, зменшується.

Мал. 6. Розмаїття білків, що у РНК-интерференции і
Цифри позначають кількість білків кожної групи. Синім кольором підсвічені елементи, характерні для кіРНК та мікроРНК, а червоним – білки, пов'язані з піРНК. За даними .

Явище РНК-інтерференції почали використовувати найпростіші організми. На основі цього механізму природа створила прототип імунної системи, а з ускладненням організмів РНК-інтерференція стає незамінним регулятором активності геному. Два різні механізми плюс три види коротких РНК (див. зведену таблицю) – у результаті бачимо тисячі тонких регуляторів різних метаболічних і генетичних шляхів. Ця разюча картина ілюструє універсальність та еволюційну адаптацію молекулярних біологічних систем. Короткі РНК знову доводять, що «дрібниць» усередині клітини немає – є лише дрібні молекули, всю роль ролі яких ми тільки починаємо розуміти.

Щоправда, така фантастична складність свідчить швидше про те, що еволюція «сліпа» діє без наперед затвердженого «генерального плану».

Література

Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Застосувати цукерки з вогнищами та засобами для вивчення messenger RNA і його переведення в living cells . Nature 233, 177-182;
Спірін А. С. (2001). Біосинтез білків, світ РНК та походження життя. Вісник РАН 71, 320-328;
Елементи: "Повні мітохондріальні геноми вимерлих тварин тепер можна витягати з волосся";
Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. (1998). Potent і specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 391, 806-311;
Біомолекула: «МікроРНК вперше виявлено в одноклітинному організмі»;
Covey S., Al-Kaff N., Langara A., Turner D. (1997). Plants combat infection by gene silencing. Nature 385, 781-782;
Біомолекула: «Молекулярне дворушництво: гени людини працюють на вірус грипу»;
Ren B. (2010). Перенесення: Enhancers make non-coding RNA . Nature 465, 173-174;
Taganov K.D., Boldin M.P., Chang K.J., Baltimore D. (2006). NF-κB-dependent induction of microRNA miR-146, an inhibitor targeted до signaling proteins of innate immune responses . Proc. Natl. Acad. SCI. U.S.A. 103, 12481-12486;
O'Connell R.M., Rao D.S., Chaudhuri A.A., Boldin M.P., Taganov K.D., Nicoll J., Paquette R.L., Baltimore D. (2008). З'ясувалося, що microRNA-155 в емато-поетичних стім клітинах спричиняє міелопроліферативний розчинник. J. Exp. Med. 205, 585-594;
Біомолекула: "мікроРНК - що далі в ліс, тим більше дров";
Елементи: "Ускладнення організму у стародавніх тварин було пов'язане з появою нових регуляторних молекул";
Grimson A., Srivastava M., Fahey B., Woodcroft BJ, Chiang HR, King N., Degnan BM, Rokhsar D.S., Bartel D.P. (2008). Найперші origins and evolution of microRNAs and Piwi-interacting RNAs in animals . Nature 455, 1193-1197.
Aravin A., Hannon G, Brennecke J. (2007). The Piwi-piRNA Pathway забезпечує Adaptive Defense в Transposon Arms Race . Science 318, 761-764;
Біомолекула: «

), запобігаючи трансляції мРНК на рибосомах в білок, що нею кодується. Зрештою результат дії малих інтерферуючих РНК ідентичний тому, якби просто знижувалася експресія гена.

Малі інтерферуючі РНК були відкриті в 1999 році групою Девіда Болкомба (англ. David Baulcombe) у Великій Британії як компонент системи пост-транскрипційного сайленсингу генів у рослин (англ. PTGS, en:post-transcriptional gene silencing). Група опублікувала отримані дані в журналі Science.

Дволанцюгові РНК можуть посилювати експресію генів за механізмом, що називається РНК-залежною активацією генів (англ. RNAa, невеликий RNA-індукований ген activation). Показано, що дволанцюгові РНК, комплементарні промоторам генів-мішеней, викликають активацію відповідних генів. РНК-залежна активація при введенні синтетичних дволанцюгових РНК була показана для клітин людини. Не відомо, чи є подібна система у клітинах інших організмів.

Даючи можливість вимкнути по суті будь-який ген за бажанням, РНК-інтерференція на основі малих РНК, що інтерферують, викликала величезний інтерес у фундаментальній і прикладній біології. Число широкоохоплювальних тестів на основі РНК-інтерференції для виявлення важливих генів у біохімічних шляхах постійно зростає. Оскільки розвиток хвороб також зумовлено активністю генів, очікується, що в деяких випадках виключення гена за допомогою малої РНК, що інтерферує, може давати терапевтичний ефект.

Однак застосування РНК-інтерференції на основі малих РНК, що інтерферують, до тварин, і особливо до людей, стикається з безліччю труднощів. В експериментах було показано, що ефективність малих інтерферуючих РНК виявляється різною для різних типів клітин: одні клітини легко відгукуються на вплив малих інтерферуючих РНК і демонструють зниження експресії генів, а в інших подібного не спостерігається, незважаючи на ефективну трансфекцію. Причини цього явища поки що погано вивчені.

Результати першої фази випробувань двох перших терапевтичних препаратів, що діють за механізмом РНК-інтерференції (призначені для лікування макулодистрофії), опубліковані наприкінці 2005 року, показують, що препарати на основі малих РНК, що інтерферують легко переносяться пацієнтами і мають прийнятні фармакокінетичні властивості.

Попередні клінічні випробування малих інтерферуючих РНК, орієнтованих на вірус Ебола, вказують на те, що вони можуть бути ефективними для постконтактної профілактики захворювання. Цей препарат дозволив вижити всій групі піддослідних приматів, які отримали летальну дозу Заїрського Еболавірусу.

Стаття на конкурс «біо/мол/текст»: В останні роки РНК – а особливо її «некласичні» різновиди – приковує увагу біологів усього світу. З'ясувалося, що регуляція за допомогою РНК, що не кодують, широко поширена - починаючи від вірусів і бактерій і закінчуючи людиною. Вивчення різноманітності малих бактеріальних РНК-регуляторів ясно показало їх важливу роль як у проміжному метаболізмі, так і адаптивних реакціях. У цій статті описані різновиди малих РНК бактерій та механізми регуляції, які здійснюються за їх допомогою. Особливий акцент зроблено на ролі цих молекул у життєдіяльності бактеріальних агентів, які викликають особливо небезпечні інфекції.

РНК: більше, ніж просто копія ДНК

Зі шкільної лави більшості читачів цього сайту відомі основні механізми роботи живої клітини. У курсі біології, починаючи з законів Менделя і закінчуючи ультрасучасними проектами із секвенування геномів, червоною ниткою проходить ідея магістральної генетичної програми розвитку організму, відома професійним біологам як центральна догма молекулярної біології. Вона свідчить, що молекула ДНК виступає носієм та зберігачем генетичної інформації, яка через посередника - матричну РНК (мРНК), та за участю рибосомальної (рРНК) та транспортної РНК (тРНК), - реалізується у вигляді білків. Останні визначають видовий та індивідуальний фенотип.

Такий стан справ та відведення РНК ролі другорядного учасника молекулярного спектаклю зберігалося у науковому середовищі аж до 80-х років минулого століття. Пильніше придивитися до РНК змусили роботи Т. Чека, який показав, що РНК може бути каталізатора хімічних реакцій. Насамперед вважалося, що прискорення хімічних процесів у клітині - прерогатива ферментів, що мають виключно білкову природу. Відкриття каталітичної активності у РНК мало далекосяжні наслідки - разом із ранніми теоретичними роботами До. Вёзе і , воно дозволило намалювати можливу картину пребіотичної еволюції нашій планеті. Справа в тому, що з моменту відкриття у ДНК функції носія генетичної інформації дилема про те, що з'явилося в ході еволюції раніше - ДНК або білок, необхідний для відтворення ДНК, - здавалася майже такою ж філософською (тобто безпредметною), як і питання про першість появи курки чи яйця. Після відкриття Т. Чека рішення набуло цілком реальних обрисів - було знайдено молекулу, що має властивості як носія інформації, так і біокаталізатора (нехай і в зародковому вигляді). Згодом ці дослідження переросли у цілий напрямок у біології, що вивчає виникнення життя через призму так званого «світу РНК».

Так стало очевидно, що давній світ РНК міг мати відношення до зародження та розквіту первинного життя. Тим не менш, з цього зовсім не випливає автоматично, що РНК у сучасних організмів - не архаїзм, адаптований під потреби внутрішньоклітинних молекулярних систем, а справді важливий учасник молекулярного ансамблю клітини. Лише розвиток молекулярних методів - зокрема, секвенування нуклеїнових кислот - показало, що РНК істинно незамінні в клітині, причому не тільки у вигляді канонічної трійці «мРНК, рРНК, тРНК». Вже перші великі дані з секвенування ДНК вказали на факт, що спочатку з'явився важко - більшість її виявилася некодуючою- тобто не несе інформацію про молекули білка або «стандартних» РНК. Звичайно, частково це можна приписати «генетичному сміттю» - «вимкненим» або фрагментам геному, що втратили свою функцію. Але зберігати таку кількість «посаг» для біологічних систем, які намагаються витрачати енергію економно, здається нелогічним.

Більш детальні і тонкі методи дослідження дозволили виявити цілий клас РНК-регуляторів експресії генів, що частково заповнюють міжгенний простір. Ще до прочитання повних послідовностей геномів еукаріотів у круглого хробака С. elegansбули виділені мікроРНК – молекули невеликої довжини (близько 20 нуклеотидів), які можуть специфічно зв'язуватися з ділянками мРНК за принципом комплементарності. Нескладно здогадатися, що в таких випадках з мРНК вже не прочитати інформацію про кодовані білки: рибосома просто не може «пробігтися» такою ділянкою, що раптово стала дволанцюжковою. Цей механізм придушення експресії гена РНК-інтерференцією, вже був розібраний на «біомолекулі» досить докладно. На сьогоднішній день відкриті тисячі молекул мікроРНК та інших некодуючих РНК (piRNA, snoRNA, nanoRNA та ін.). У еукаріотів (у тому числі і у людини) вони розташовані в міжгенних ділянках. Встановлено важливу їх роль у клітинному диференціюванні, канцерогенезі, імунній відповіді та інших процесах та патологіях.

Малі РНК – «троянський кінь» для бактеріальних білків

Незважаючи на те, що некодуючі білок РНК у бактерій були відкриті набагато раніше перших аналогічних регуляторів у еукаріотів, їхня роль у метаболізмі бактеріальної клітини тривалий час була завуальована для наукової громадськості. Це зрозуміло - традиційно бактеріальна клітина вважалася більш примітивною і менш таємничою для дослідника структурою, складність якої не йде в жодне порівняння з нагромадженням структур у еукаріотичній клітині. Понад те, в геномах бактерій вміст некодирующей інформації становить лише кілька відсотків загальної довжини ДНК, досягаючи максимум 40% в деяких мікобактерій. Але з огляду на те, що мікроРНК виявлено навіть у вірусів, у бактерій вони повинні відігравати важливу регуляторну роль і поготів.

Виявилося, у прокаріотів існує чимало малих РНК-регуляторів. Умовно всі вони можуть бути поділені на дві групи:

Молекули РНК, які для здійснення своєї функції повинні зв'язатися з білками.
РНК, що комплементарно зв'язуються з іншими РНК (становлять більшість відомих регуляторних молекул РНК).

У першій групі виділяють малі РНК, котрим зв'язування з білком можливе, але необов'язково. Відомий приклад - РНКаза Р (RNAse P), що діє як рібозім на «дозріває» тРНК. Однак якщо РНКаза Р може функціонувати без білкового компонента, то для інших малих РНК у цій групі зв'язування з білком є обов'язковим (а самі вони є, по суті, кофакторами). Наприклад, tmРНК активує складний білковий комплекс, виступаючи в ролі «відмички» для рибосоми, що «застрягла» - у разі, якщо матрична РНК, з якою ведеться зчитування, добігла кінця, а стоп-кодон так і не зустрівся.

Відомий ще більш інтригуючий механізм безпосередньої взаємодії малих РНК з білками. У будь-якій клітині широко поширені білки, що зв'язуються з «традиційними» нуклеїновими кислотами. Чи не є винятком і прокаріотична клітина. Наприклад, її гістоноподібні білки допомагають коректно запакувати нитку ДНК, а специфічні білки-репресори мають спорідненість до операторної області бактеріальних генів. Показано, що ці репресори можуть пригнічуватися малими РНК, що імітують «рідні» для цих білків ділянки посадки на ДНК. Так, на малій РНК CsrB (рис. 1) є 18 сайтів-«обманок» службовців тому, щоб білок-репресор CsrA не зміг дістатися своєї справжньої мішені - глікогенового оперону. Між іншим, серед білків-репресорів, які «заблукали» через такі малі РНК, зустрічаються регулятори глобальних метаболічних шляхів, що дозволяє багаторазово посилювати інгібуючий сигнал малої РНК. Наприклад, так робить мала РНК 6S, що «імітує» білковий фактор 70 . Конфігураційним «обманом» займаючи центри зв'язування РНК-полімерази з сигма-фактором, вона забороняє експресію генів «домашнього господарства».

Малюнок 1. Біоінформатично передбачена вторинна структура малої РНК CsrB з Vibrio cholerae M66-2.Малі РНК – одноланцюгові молекули, але, як і для інших РНК, згортання (фолдинг) у стабільну просторову структуру супроводжується формуванням ділянок, де молекула гібридизується сама на себе. Численні вигини на структурі у вигляді розімкнутих кілець називаються шпильками. У деяких випадках комбінація шпильок дозволяє РНК грати роль "губки", нековалентно пов'язуючи певні білки. Але частіше молекули такого типу інтерферують із ДНК або РНК; при цьому просторова структура малої РНК порушується, і утворюються нові ділянки гібридизації вже з молекулою-мішенню. Теплова карта відображає ймовірність того, що відповідна пара нуклеотидів дійсно буде пов'язана з внутрішньомолекулярним водневим зв'язком; для неспарених ділянок - можливість утворити водневі зв'язки з будь-якими ділянками всередині молекули. Зображення отримано за допомогою програми RNAfold.

Малі РНК бактерій інтерферують і дуже успішно!

Механізм, за яким діють регулятори другої групи, загалом, схожий з таким у регуляторних РНК еукаріотів - це та ж РНК-інтерференція шляхом гібридизації з мРНК, тільки самі ланцюжки малих РНК найчастіше довше - до декількох сотень нуклеотидів ( див.Мал. 1). В результаті, через малу РНК рибосоми не можуть рахувати інформацію з мРНК. Хоча найчастіше, схоже, не доходить і до цього: комплекси «мала РНК - мРНК», що утворилися, стають мішенню РНКаз (типу РНКази Р) .

Компактність і щільність упаковки прокаріотичного геному дається взнаки: якщо в еукаріотів більшість регуляторних РНК записані в окремих (найчастіше не кодують білок) локусах, то багато малі РНК бактерій можуть кодуватися в тій же ділянці ДНК, що і ген, що пригнічується, але на протилежній ланцюги! Такі РНК називаються цис-кодованими(антисмисловими), а малі РНК, що лежать на деякому віддаленні від пригнічуваної ділянки ДНК - транс-кодуються. Мабуть, розташування цис-РНК можна вважати торжеством ергономічності: вони можуть зчитуватися з протилежного ланцюга ДНК в момент її розплетення одночасно з транскриптом-мішенню, що дозволяє тонко керувати кількістю білка, що синтезується.

Малі РНК у транс-положенні еволюціонують незалежно від цільової мРНК, і послідовність регулятора сильніше змінюється внаслідок мутацій. Можливо, такий розклад бактеріальній клітині лише «на руку», оскільки мала РНК набуває активності щодо раніше невластивих їй мішеней, що скорочує час та енергетичні витрати на створення інших регуляторів. З іншого боку, тиск відбору не дозволяє транс-малій РНК мутувати занадто сильно, оскільки вона втратить активність. Тим не менш, для гібридизації з матричною РНК більшості транс-малих РНК необхідний помічник – білок Hfq. Очевидно, інакше неповна комплементарність малої РНК може створювати проблеми зв'язування з мішенню.

Очевидно, механізм регуляції, що потенційно реалізується, за принципом «одна мала РНК - безліч мішеней» допомагає інтегрувати метаболічні мережі бактерії, що вкрай необхідно в умовах короткого одноклітинного життя. Можна продовжити спекуляцію на тему і припустити, що за допомогою транс-кодованих малих РНК здійснюється пересилання експресійних «розпоряджень» з функціонально пов'язаних, але фізично віддалених локусів. Необхідністю в подібного роду генетичної «перекличці» логічно пояснюється велика кількість малих РНК, виявлених у патогенних бактерій. Наприклад, кілька сотень малих РНК знайдено у рекордсмена за цим показником – холерного вібріона ( Vibrio cholerae). Це мікроорганізм, який вміє виживати і в навколишньому водному середовищі (як прісному, так і солоному), і на водних молюсках, і в рибі, і в кишечнику людини – тут без комплексної адаптації за допомогою регуляторних молекул не обійтися!

CRISPR на варті бактеріального здоров'я

Знайшлося застосування малим РНК і у вирішенні іншої насущної для бактерій задачі. Навіть найзлісніші патогенні коки і палички можуть виявитися безсилими перед небезпекою, що походить від особливих вірусів - бактеріофагів, здатних блискавично винищити бактеріальну популяцію. У багатоклітинних організмів для захисту від вірусів існує спеціалізована система. імунна, засобами клітин та виділених ними речовин, що охороняє організм від непроханих гостей (у тому числі, вірусної природи). Бактеріальна клітина - одинак, але вона не так уразлива, як може здатися на перший погляд. Охоронцями рецептів для підтримки противірусного імунітету бактерій виступають локуси CRISPR- кластерні регулярно-переривчасті короткі паліндромні повтори ( clustered регулярно interspaced short palindromic repeats) (рис. 2; ). У геномах прокаріотів кожна CRISPR-касета представлена лідерною послідовністю довжиною кілька сотень нуклеотидів, за якою слідує серія з 2-24 (іноді до 400) повторів, розділених спейсерними ділянками, схожими між собою за довжиною, але унікальними за нуклеотидною послідовністю. Довжина кожного спейсера та повтору не перевищує сотні пар нуклеотидів.

Рисунок 2. CRISPR-локус та процесинг відповідної йому малої РНК до функціонального транскрипту.У геномі CRISPR-Касета представлена спейсерами, що перемежуються між собою (на малюнку позначені як Сп), частково гомологічними ділянкам фагової ДНК, та повторами ( за) довжиною 24-48 п.н., що демонструють діадну симетрію. На противагу повторам, спейсери всередині одного локусу однакові за довжиною (у різних бактерій це може бути 20-70 нуклеотидів), але відрізняються за нуклеотидною послідовністю. Ділянки «спейсер-повтор» можуть бути досить протяжними і складатися з декількох сотень ланок. Уся структура фланкується з одного боку лідерною послідовністю ( ЛП, кілька сотень пар основ). Неподалік знаходяться Cas-гени ( C RISPR-as sociated), організовані в оперон. Білки, що зчитуються з них, виконують низку допоміжних функцій, забезпечуючи процесинг транскрипта, ліченого з CRISPR-Локуса, його успішну гібридизацію з фагової ДНК-мішенню, вбудовування нових елементів у локус і т.д. СрRNA, що утворюється в результаті багатоетапного процесингу, гібридизується з ділянкою ДНК (нижня частина малюнка), що впорскується фагом в бактерію. Це змушує «замовчати» транскрипційну машину вірусу та зупиняє його розмноження у прокаріотичній клітині.

Детальний механізм виникнення всього CRISPR-Локуса ще належить вивчити. Але на сьогоднішній день запропоновано принципову схему виникнення спейсерів - найважливіших структур у його складі. Виявляється, «мисливці за бактеріями» виявляються биті їхньою ж зброєю – нуклеїновими кислотами, а точніше – «трофейною» генетичною інформацією, отриманою бактеріями від фагів у колишніх битвах! Справа в тому, що не всі фаги, що потрапили до бактеріальної клітини, виявляються згубними. ДНК таких фагів (можливо, що належать до помірних) ріжеться спеціальними Cas-білками (їх гени фланкують CRISPR) на дрібні фрагменти. Частина цих фрагментів буде вбудована в CRISPR-Локуси «господарського» геному. І коли фагова ДНК знову потрапляє в бактеріальну клітину, вона зустрічається з малою РНК CRISPR-локусу, що в той момент експресується і обробляється Cas-білками. Після цього відбувається інактивація вірусної генетичної інформації за вже описаним вище механізмом РНК-інтерференції.

З гіпотези формування спейсерів неясно, навіщо між ними потрібні повтори, що всередині одного локусу незначно відрізняються за довжиною, але практично ідентичні за послідовністю? Тут відкривається широкий простір фантазії. Можливо, без повторів було б проблематично здійснити розбиття генетичних даних на смислові фрагменти, подібні до секторів на жорсткому диску комп'ютера, і тоді доступ транскрипційної машини до строго певних ділянок. CRISPR-Локуса став би скрутним? А може, повтори спрощують рекомбінаційні процеси при вбудовуванні нових елементів фагової ДНК? Або ж вони - «розділові знаки», без яких не обійтися при процесингу CRISPR? Як би там не було, біологічна причина, яка пояснює поведінку бактеріальної клітини на кшталт гоголівського Плюшкіна, свого часу буде знайдено.

CRISPR, будучи «літописом» взаємовідносин бактерії з фагом, можна використовувати у філогенетичних дослідженнях. Так, нещодавно здійснене типування по CRISPRдозволило окинути поглядом еволюцію окремих штамів чумного мікроба ( Yersinia pestis). Дослідження їх CRISPR-«родоводів» пролило світло на події півтисячолітньої давнини, коли штами проникли в Монголію з території, що в даний час відноситься до Китаю. Але не для всіх бактерій, і, зокрема, патогенів, цей метод можна застосувати. Незважаючи на нещодавні відомості про передбачені CRISPR-обробні білки у збудників туляремії ( Francisella tularensis) і холери , самі CRISPR, якщо і присутні в їхньому геномі, то нечисленні. Можливо, фаги, враховуючи їхній позитивний внесок у придбання вірулентності патогенними представниками бактеріального царства, не такі вже шкідливі та небезпечні, щоб захищатися від них за допомогою CRISPR? Чи віруси, що атакують ці бактерії, занадто різноманітні, і стратегія «інтерферуючого» РНК-імунітету щодо них безплідна?

Рисунок 3. Деякі механізми роботи рибосвитчей.Рибосвітчі (рибоперемикачі) вбудовані в матричну РНК, але відрізняються великою свободою конформаційної поведінки, яка залежить від специфічних лігандів, що дає підставу вважати рибосвітчі самостійними одиницями малих РНК. Зміна конформації експресійної платформи впливає сайт посадки рибосоми на мРНК ( RBS), і, як наслідок, визначає доступність всієї мРНК для зчитування. Рибосвітчі певною мірою аналогічні операторній області в класичній моделі lac-оперона - але тільки аптамерні ділянки зазвичай регулюються низькомолекулярними речовинами та здійснюють перемикання роботи гена на рівні мРНК, а не ДНК. а - За відсутності лігандів рибосвітчі btuB (кобаламінового транспортера)і thiM (тіамінпірофосфат-залежний), що здійснюють ненуклеолітичну репресію мРНК, «включаються» ( ON) і дозволяють рибосомі зайнятися своєю справою. Зв'язування ліганду з рибосвітчем ( OFF-положення) наводить формуванню шпильки, що робить цю ділянку недоступною для рибосоми. б - Лізиновий рибосвітч lysCза відсутності ліганду також включено ( ON). Вимкнення рибосвітча блокує рибосому доступ до мРНК. Але на відміну від описаних вище рибосвитчей, в лізиновому при виключенні «оголюється» ділянка, що розрізається спеціальним РНКазним комплексом ( degradosome), і вся мРНК утилізується, розпадаючись на дрібні фрагменти. Репресія рибосвитчем у разі називається нуклеолитической ( nucleolytic) і необоротна, оскільки, на відміну від прикладу ( а ), зворотне перемикання (знов у ON) вже неможливо. Таким чином може досягатися утилізація групи «непотрібних» мРНК: рибосвитч схожий на деталь дитячого конструктора, і схожі за структурою перемикачі можуть бути у цілої групи функціонально пов'язаних матричних молекул.

Рибосвітч - датчик для бактерії

Отже, є білок-асоціюючі малі РНК, малі РНК, що інтерферують з власними мРНК бактерій, а також РНК, захоплені бактеріями з вірусів і пригнічують фагову ДНК. Хіба можна уявити якийсь ще механізм регуляції за допомогою малих РНК? Виявляється, так. Якщо проаналізувати описане вище, то виявиться, що у всіх випадках антисмислового регулювання спостерігається інтерференція малої РНК і мішені як результат гібридизації двох окремихмолекул. А чому б не розташувати малу РНК у складі самого транскрипту? Тоді можна, змінюючи конформацію такого «засланого козачка» усередині мРНК, змінювати доступність всієї матриці для зчитування при трансляції або, що енергетично ще доцільніше, регулювати біосинтез мРНК, тобто. транскрипцію!

Такі структури широко представлені в бактеріальних клітинах і відомі як рибосвітчі ( riboswitch). Вони розташовуються перед початком кодуючої частини гена, на 5′ кінці мРНК. Умовно у складі рибосвітів можна виділити два структурні мотиви: аптамерна ділянка, відповідальний за зв'язування з лігандом (ефектором), та експресійну платформу, що забезпечує регулювання експресії гена за допомогою переходу мРНК в альтернативні просторові структури . Наприклад, такий перемикач («вимикаючого» типу) використовується для функціонування лізинового оперону: при надлишку лізину він існує у вигляді «заплутаної» просторової структури, що блокує зчитування з оперону, а при його нестачі рибосвитч «розплітається», та синтезуються білки, необхідні для біосинтезу лізину (рис. 3).

Описана важлива схема пристрою рибосвитча - не канон, існують варіанти. Цікавий «включаючий» тандемний рибосвитч виявлений у холерного вібріона: експресійній платформі передують відразу двааптамерні ділянки. Очевидно, це забезпечує більшу чутливість і плавнішу відповідь на появу в клітині ще однієї амінокислоти - гліцину. Можливо, побічно причетний до високої виживаності бактерії схожий за принципом дії, але «подвійний» рибосвитч в геномі збудника сибірки ( Bacillus anthracis). Він реагує на вхідне до складу мінімального середовища життєво важливе для цього мікроба з'єднання - тіамінпірофосфат.

Крім перемикання метаболічних шляхів, залежно від доступного для бактеріальної клітини «меню», рибосвітчі можуть бути датчиками гомеостазу бактерії. Так, вони були помічені в регуляції доступності гена для зчитування при порушенні функціонування трансляційної системи всередині клітини (наприклад, такі сигнали як поява "незаряджених" тРНК і "несправних" (stalled) рибосом), або при зміні факторів зовнішнього середовища (наприклад, підвищення температури ).

Не треба білків, дайте нам РНК!

То що означає наявність такого розмаїття малих РНК-регуляторів усередині бактерії? Чи це свідчить про відмову від концепції, коли головними «управлінцями» є білки, чи ми спостерігаємо черговий модний тренд? Мабуть, ні те, ні інше. Звісно, деякі малі РНК є глобальними регуляторами метаболічних шляхів - як згадана CsrB, що бере участь, разом із CsrС, у регуляції запасання органічного вуглецю. Але, зважаючи на принцип дублювання функцій у біологічних системах, малі РНК бактерій можна порівняти швидше з «антикризовим менеджером», ніж з генеральним директором. Так, в умовах, коли для виживання мікроорганізму потрібно швидкопереналаштувати внутрішньоклітинний метаболізм, їхня регуляторна роль може виявитися вирішальною і ефективнішою, ніж у білків з аналогічними функціями. Таким чином, РНК-регулятори відповідають, швидше, за експрес-реагування, менш стійке і надійне, ніж у випадку з білками: не слід забувати, що мала РНК підтримує свою 3D-структуру і утримується на матриці, що інгібується слабкими водневими зв'язками.

Непрямим підтвердженням цих тез можуть стати вже згадувані малі РНК холерного вібріона. Для цієї бактерії попадання в організм людини – не бажана мета, а, мабуть, надзвичайна ситуація. Вироблення токсинів та активація інших, пов'язаних з вірулентністю, шляхів у даному випадку – лише захисна реакція на агресивну протидію середовища та клітин організму «чужакам». "Рятувальниками" тут виступають малі РНК - наприклад Qrr, що допомагають вібріону в стресових умовах модифікувати стратегію виживання, змінюючи колективну поведінку. Непрямо підтвердити цю гіпотезу може також відкриття малої РНК VrrA, що активно синтезується при знаходженні вібріонів в організмі та пригнічує напрацювання мембранних білків Omp. «Сховані» мембранні білки у початковій фазі інфікування, можливо, допомагають уникнути потужної імунної відповіді з боку організму людини (рис. 4).

Малюнок 4. Малі РНК у реалізації патогенних властивостей холерного вібріона. а - Холерний вібріон добре почувається і чудово розмножується у водному середовищі. Організм людини, мабуть, перестав бути основний екологічної нішою цього мікроба. б - Потрапляючи водним чи харчовим шляхом передачі інфекції в агресивне середовище - тонкий кишечник людини, - вібріони за організованістю поведінки починають нагадувати псевдоорганізм, основне завдання якого - стримати імунну відповідь і створити собі сприятливе середовище для колонізації. Велике значення у координації дій усередині популяції бактерій та їх взаємодії з організмом приділяється мембранним везикулам. До кінця невивчені фактори середовища в кишечнику є сигналами для експресії у вібріонах малих РНК (наприклад, VrrA). В результаті запускається механізм утворення везикул, які є неімуногенними при низькій кількості клітин вібріона в кишечнику. Додатково до описаного ефекту малі РНК допомагають "заховати" потенційно провокаційні для імунної системи людини мембранні білки Omp. За непрямої участі малих РНК Qrr1-4 запускається інтенсивна вироблення холерного токсину (не показано малюнку), що доповнює спектр адаптивних реакцій холерного вібріона. в - Вже за кілька годин кількість бактеріальних клітин зростає, а пул малих РНК VrrA зменшується, що, ймовірно, призводить до експонування мембранних білків. Кількість «порожніх» везикул також поступово зменшується, і на цьому етапі вони замінюються на імунногенні, що доставляють ентероцити. Мабуть, це частина плану з реалізації комплексного сигналу, сенс якого - спровокувати евакуацію вібріонів з організму людини. NB: співвідношення розмірів бактеріальних клітин та ентероцитів не дотримано.

Цікаво простежити, як зміняться наші уявлення про малі РНК-регулятори, коли будуть отримані нові дані на платформах RNAseq, у тому числі, за вільноживучим і некультивованих форм. Нещодавні роботи з використанням «глибокого секвенування» вже дали несподівані результати, вказавши на наявність мікроРНК-подібних молекул у мутантних стрептококів. Звичайно, такі дані потребують ретельної перевірки, але, як би там не було, можна з впевненістю стверджувати, що вивчення малих РНК у бактерій піднесе чимало сюрпризів.

Подяки

Оригінальні ідеї та композиційне оформлення при створенні великого малюнка, а також малюнка 4 належать випускниці Іархії ЮФУ Копаєвої О.О. Наявність у статті малюнка 2 – заслуга доцента каф. зоології ПФУ Г.Б. Бахтадзе. Він здійснив наукову коректуру і доопрацювання великого малюнка і рисунка 4. Автор висловлює їм велику вдячність за терпіння і творчий підхід до справи. Окрема подяка колезі, с.м.с. лаб. біохімії мікробів Ростовського протичумного інституту Сорокіну В.М. за обговорення тексту статті та висловлені цінні зауваження.

Література

Карл Вёзе (1928-2012);;. 80 , 1148-1154;
RR Breaker. (2012). Riboswitches and the RNA World . Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 , a003566-a003566;
J. Patrick Bardill, Brian K. Hammer. (2012). Non-coding sRNAs regulate virulence in bacterial pathogen Vibrio cholerae . RNA Biology. 9 , 392-401;
Heon-Jin Lee, Su-Hyung Hong. (2012). Analysis of microRNA-size, малих RNAs в Streptococcus mutans by deep sequencing . FEMS Microbiol Lett. 326 , 131-136;
M-P. Caron, L. Bastet, A. Lussier, M. Simoneau-Roy, E. Masse, D. A. Lafontaine. (2012). Dual-acting riboswitch control of translation initiation and mRNA decay . Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 , E3444-E3453.

Як вважають вчені, невірна експресія малих РНК є однією з причин цілого ряду захворювань, що дуже серйозно впливають на здоров'я багатьох людей у всьому світі. Серед таких захворювань - серцево-судинні 23 та онкологічні 24 . Щодо останніх, то це не дивно: рак свідчить про аномалії у розвитку клітин та їх долі, а малі РНК відіграють найважливішу роль відповідних процесах. Ось один із дуже показових прикладів величезного впливу, який малі РНК надають на організм при онкологічних захворюваннях. Мова йде про злоякісну пухлину, для якої характерна невірна експресія тих генів, які діють у період початкового розвитку організму, а не постнатальний період. Це різновид дитячої пухлини мозку, що зазвичай з'являється ще до дворічного віку. На жаль, це дуже агресивна форма раку, і прогноз тут несприятливий навіть за інтенсивного лікування. Онкологічний процес розвивається внаслідок неправильного перерозподілу генетичного матеріалу у клітинах мозку. Промотор, який зазвичай викликає сильну експресію одного з генів, що кодують білки, зазнає рекомбінації з певним кластером малих РНК. Потім вся ця перебудована ділянка проходить ампліфікацію: іншими словами, створюється безліч його копій у геномі. Отже, малі РНК, розташовані «нижче за течією», ніж переміщений промотор, експресуються набагато сильніше, ніж слід. Рівень вмісту активних малих РНК при цьому приблизно в 150-1000 разів вищий за норму.

Мал. 18.3.Малі РНК, активовані алкоголем, можуть з'єднуватися з інформаційними РНК, які впливають стійкість організму до впливу алкоголю. Але ці малі РНК не поєднуються з молекулами інформаційної РНК, що сприяють такій стійкості. Це призводить до відносного переважання частки молекул інформаційної РНК, що кодують варіації білка, пов'язані зі стійкістю до алкоголю.

Цей кластер кодує понад 40 різних малих РНК. Власне, це взагалі найбільший із подібних кластерів, що є у приматів. Зазвичай він експресується лише на ранній стадії людського розвитку, у перші 8 тижнів життя ембріона. Сильна активація його в мозку дитини призводить до катастрофічного впливу на генетичну експресію. Один із наслідків - експресія епігенетичного білка, що додає модифікації до ДНК. Це призводить до широкомасштабних змін у всій картині метилювання ДНК, а значить, і до аномальної експресії всіляких генів, багато з яких повинні експресуватися лише тоді, коли незрілі клітини мозку діляться в ході ранніх етапів розвитку організму. Так, у клітинах немовляти і запускається ракова програма 25 .

Подібне спілкування між малими РНК та епігенетичною апаратурою клітини може істотно впливати і на інші ситуації, коли в клітинах розвивається схильність до раку. Цей механізм, ймовірно, призводить до того, що вплив порушення експресії малих РНК посилюється шляхом зміни епігенетичних модифікацій, що передаються дочірнім клітинам від материнської. Так може складатися схема потенційно небезпечних змін у характері експресії генів.

Поки вчені розібралися не в усіх етапах взаємодії малих РНК з епігенетичних процесів, але деякі натяки на особливості того, що відбувається все-таки вдається отримати. Наприклад, з'ясувалося, що певний клас малих РНК, що посилює агресивність раку грудей, таргетує в інформаційних РНК певні ферменти, що видаляють ключові епігенетичні модифікації. Це змінює картину епігенетичних модифікацій у раковій клітині та ще більше порушує генетичну експресію 26 .

Багато форм раку відстежувати у пацієнта досить складно. Онкологічні процеси можуть у важкодоступних місцях, що ускладнює процедуру відбору проб. У таких випадках лікарю нелегко стежити за розвитком ракового процесу та реакцією на лікування. Часто медики змушені покладатися на непрямі виміри – скажімо, томографічне сканування пухлини. Деякі дослідники вважають, що молекули малих РНК могли допомогти створити нову методику спостереження над розвитком пухлини, що дозволяє також вивчати її походження. Коли ракові клітини гинуть, під час розриву клітини її залишають малі РНК. Ці невеликі сміттєві молекули нерідко утворюють комплекси з клітинними білками або ж завертаються у фрагменти клітинних мембран. Завдяки цьому вони дуже стабільні у рідких середовищах організму, а отже, такі РНК можна виділити та проаналізувати. Оскільки їх кількість невелика, дослідники змушені будуть використовувати дуже чутливі методи аналізу. Втім, тут немає нічого неможливого: чутливість секвенування нуклеїнових кислот постійно підвищується. Опубліковано дані, що підтверджують перспективність такого підходу стосовно раку грудей 28 , раку яєчників 29 та інших онкологічних захворювань. Аналіз малих циркулюючих РНК у хворих на рак легенів показав, що ці РНК допомагають провести різницю між пацієнтами з одиночним легеневим вузликом (що не потребують терапії) та пацієнтами, у яких утворюються злоякісні вузлики-пухлини (що вимагають лікування) 30 .

Матеріали на тему:

Карта сайту