Тема 2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ У ГІСТОЛОГІЇ. ПРИГОТУВАННЯ ГІСТОЛОГІЧНОГО ПРЕПАРАТУ

p align="justify"> Основним методом дослідження в гістології є мікроскопування - вивчення гістологічних препаратів під мікроскопом. Останнім часом мікроскопія поєднується з іншими методами – гістохімією та гісторадіографією. Для мікроскопії використовують різноманітні конструкції мікроскопів, що дозволяють вивчати різні параметри гістологічних препаратів.

Виділяються такі види мікроскопії:

1) світлова мікроскопія (найпоширеніший вид мікроскопії, у своїй роздільна здатність мікроскопа становить 0,2 мкм);

2) ультрафіолетова мікроскопія (роздільна здатність мікроскопа становить 0,1 мкм);

3) люмінісцентна мікроскопія (застосовується для визначення у досліджуваному гістологічному препараті певних хімічних структур);

4) фазово-контрастна мікроскопія (застосовується для виявлення та вивчення певних структур у незабарвлених гістологічних препаратах);

5) поляризаційна мікроскопія (використовується в основному для вивчення волокнистих структур);

6) мікроскопія у темному полі застосовується вивчення живих об'єктів;

7) мікроскопія в падаючому світлі (призначена для вивчення товстих об'єктів);

8) електронна мікроскопія (найсучасніший вид мікроскопії, має роздільну здатність 0,1 – 0,7 нм). Є два різновиди електронної мікроскопії - просвічуюча (трансмісійна) і скануюча (або розчинна) мікроскопія, що дає відображення поверхневих ультраструктур.

Гістологічні та цитохімічні методи застосовуються для визначення складу хімічних речовин та їх кількості у певних структурах. Принцип методу полягає у хімічній реакції між реактивом і субстратом, що міститься в досліджуваній речовині. При цьому побічні продукти реакції, що утворюються, можна виявити за допомогою світлової або люмінісцентної мікроскопії.

Метод гістоавторадіографії дозволяє виявити склад хімічних речовин у досліджуваних структурах та інтенсивність обміну щодо включення радіоактивних ізотопів. Цей метод найчастіше використовується при експериментах на тваринах.

Метод інтерферонометрії дозволяє визначати суху масу речовини у живих чи фіксованих об'єктах.

Метод культури клітин – це вирощування клітин у пробірках чи спеціальних капсулах в організмі і подальше вивчення живих клітин під мікроскопом.

Метод вітального фарбування - введення тваринам у кров або черевну порожнину барвника (трепанового синього), який за життя тварини захоплюється певними клітинами - макрофагами, а після вибою тварини та приготування препарату визначаються і підраховуються клітини, що містять барвник.

Імуноморфологічні методи дозволяють за допомогою попередньо проведених імунних реакцій (на основі взаємодії антиген – антитіло) визначати субпопуляцію лімфоцитів, ступінь чужорідності клітин, проводити гістологічне типування тканин та органів, тобто визначати їхню гістосумісність для подальшої трасплантації.

Метод диференціального центрифугування – вивчення окремих органел і навіть їх фрагментів, виділених із клітини. Для цього шматочок досліджуваного органу розтирають, заливають фізіологічним розчином, а потім розганяють у центрифузі при різних обертах (від 2 до 150 тис. за 1 хв). В результаті центрифугування отримують фракції, що цікавлять, які потім вивчають різними методами.

Методи морфометрії – кількісні методи. Вони дозволяють визначати розміри та обсяги ядра – каріометрія, клітин – цитометрія, органел – електронна морфометрія, а також визначати кількість клітин різних популяцій та субпопуляцій. Дані методи широко використовуються у наукових дослідженнях.

Різні експериментальні методи – харчове та водне навантаження, фізичні методи (УВЧ, НВЧ, лазери, магніти). Вони застосовуються для вивчення реакції структур, що цікавлять, на той чи інший вплив і поєднуються з методами морфометрії, цито- і гістохімії. Ці методи також застосовуються в наукових дослідженнях.

Таким чином, основним та найбільш поширеним методом вивчення в гістології є мікроскопія. Приготування гістологічного препарату включає наступні етапи.

1. Взяття матеріалу- Шматок тканини або органу. При заборі матеріалу необхідно виконувати такі правила:

1) забір матеріалу повинен проводитися якомога раніше після смерті або вибою тварини, при можливості від живого об'єкта, щоб якнайкраще зберегти структуру досліджуваних клітин;

2) забір матеріалу повинен проводитися гострим інструментом, щоб не травмувати тканини;

3) товщина шматочка не повинна перевищувати 5 мм, щоб фіксуючий розчин зміг проникнути на всю глибину тканини;

4) обов'язково необхідно провести маркування шматочка, при цьому вказуються найменування органу, номер тварини або прізвище людини, дата забору.

2. Фіксація матеріалу. Даний етап проводиться для того, щоб зупинити обмінні процеси в клітині та зберегти її від розпаду. Для цього взятий на дослідження шматочок тканини занурюють у фіксуючий розчин. Розчин може бути простим (спирт або формалін) та складним (розчин Карнуа, фіксатор Цинкера). Фіксатор викликає денатурацію білків і зберігає структуру клітин у стані, близькому до прижиттєвого. Фіксацію можна проводити також шляхом заморожування – охолодженням рідким азотом чи струменем вуглекислого газу.

3. Заливання шматочків тканини в ущільнюючі середовища(парафін, смоли) – або заморожування. Даний етап необхідний для того, щоб у подальшому з тканини, що досліджується, можна було виготовити тонкий зріз.

4. Приготування зрізів на мікротомі або ультрамікротомі за допомогою спеціальних ножів. Після цього зрізи для світлової мікроскопії приклеюються на предметні шибки, а для електронної – монтуються на спеціальні сіточки.

5. Забарвлення зрізів або їх контрастування(Для електронної мікроскопії). Перед забарвленням зрізів необхідно видалити середовище ущільнювача - виконати депарафування. За допомогою фарбування досягається контрастність досліджуваних структур. Барвники можна поділити на основні, кислі та нейтральні. Найбільш широко застосовуються основні барвники (гематоксилін) та кислі (еозин). Часто використовуються складні барвники.

6. Просвітлення зрізів у ксилолі та толуолі. Їх укладають у смоли (бальзам та полістирол) та закривають покривним склом.

Після цих процедур препарат можна досліджувати під світловим мікроскопом. Вміщені під скло зрізи для світлового мікроскопа можуть довго зберігатися і багаторазово використовуватися. Для електронної мікроскопії кожен зріз використовується лише 1 раз, при цьому він фотографується, і вивчення структур тканин проводиться по електронограмі.

Якщо тканина має рідку консистенцію (наприклад, кров, кістковий мозок), то препарат виготовляють у вигляді мазка на предметному склі, який також фіксується, фарбується і вивчається.

З ламких паренхіматозних органів виготовляють препарати у вигляді відбитка органу, проводять розлам даного органу, потім до місця розлому прикладають предметне скло, на яке приклеюються вільні клітини. Після цього препарат фіксується та вивчається.

З деяких органів (наприклад, брижі, м'якої мозкової оболонки) або пухкої волокнистої сполучної тканини виготовляють плівкові препарати шляхом розтягування або роздавлення між двома стеклами з наступною фіксацією і заливкою в смоли.

У сучасній гістології, цитології та ембріології застосовуються різноманітні методи дослідження, що дозволяють всебічно вивчати процеси розвитку, будови та функції клітин, тканин та органів.

Головними етапами цитологічного та гістологічного аналізу є вибір об'єкта дослідження, підготовка його для вивчення у мікроскопі, застосування методів мікроскопування, а також якісний та кількісний аналіз зображень.

Об'єктами дослідження служать живі та мертві (фіксовані) клітини та тканини, та їх зображення, отримані у світлових та електронних мікроскопах.

Основним об'єктом дослідження є гістологічні препарати, виготовлені з фіксованих структур. Препарат може являти собою мазок(наприклад, мазок крові, кісткового мозку, слини, спинномозкової рідини та ін.), відбиток(наприклад, селезінки, тимусу, печінки), плівкуз тканини (наприклад, сполучної або очеревини, плеври, м'якої мозкової оболонки), тонкий зріз. Найчастіше вивчення використовується зріз тканини чи органа. Гістологічні препарати можуть вивчати без спеціальної обробки. Наприклад, приготовлений мазок крові, відбиток, плівка чи зріз органу можуть одразу розглядатися під мікроскопом. Але внаслідок того, що структури мають слабкий контраст, вони погано виявляються у звичайному світловому мікроскопі та потрібне використання спеціальних мікроскопів (фазово-контрастні та ін.). Тому частіше застосовують спеціально оброблені препарати: фіксовані, укладені у тверде середовище та забарвлені.

Процес виготовлення гістологічного препаратудля світлової та електронної мікроскопії включає такі основні етапи:

• 1. взяття матеріалу та його фіксація,
• 2. ущільнення матеріалу,
• 3. приготування зрізів,
• 4. фарбування чи контрастування зрізів.

Для світлової мікроскопії потрібен ще один етап - укладання зрізів у бальзам або інші прозорі середовища.

Фіксаціязабезпечує запобігання процесам розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу невеликий зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під дією фіксатора в тканинах та органах відбуваються складні фізико-хімічні зміни. Найбільш істотним із них є процес незворотної коагуляції білків, внаслідок якого життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими. Фіксація призводить до ущільнення та зменшення об'єму шматочків, а також до поліпшення подальшого забарвлення клітин та тканин.

Ущільненняматеріалу, необхідне приготування зрізів, проводиться шляхом просочування попередньо зневодненого матеріалу парафіном, целлоидином, органічними смолами. Швидше ущільнення досягається застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад, рідкої вуглекислоті.

Приготування зрізіввідбувається на спеціальних приладах - мікротомах(для світлової мікроскопії) та ультрамікротомах(Для електронної мікроскопії). Дивись посилання - прилади для виготовлення зрізів.

Фарбуваннязрізів (у світловій мікроскопії) або напилення їх солями металів (в електронній мікроскопії) застосовують збільшення контрастності зображення окремих структур під час розгляду в мікроскопі. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні та вибираються залежно від завдань дослідження. форум гістологічні методики.

Гістологічні барвники (за хімічною природою) поділяють на кислі, основні та нейтральні. Як приклад можна навести найбільш уживаний барвник гематоксилін, який забарвлює ядра клітин у фіолетовий колір, і кислий барвник - еозін, що забарвлює цитоплазму в рожево-жовтий колір Виборча спорідненість структур до певних барвників зумовлена ​​їх хімічним складом та фізичними властивостями. Структури, що добре фарбуються кислими барвниками, називаються оксифільними, а фарбуються основними -- базофільними. Наприклад, цитоплазма клітин найчастіше фарбується оксифільно, а ядра клітин - фарбуються базофільно.

Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними (гетерофільними). Забарвлені препарати зазвичай зневоднюють у спиртах зростаючої міцності і просвітлюють у ксилолі, бензолі, толуолі або деяких оліях. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним та покривним склом у канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат можна використовувати для вивчення під мікроскопом протягом багатьох років.

Для електронної мікроскопії зрізи, отримані на ультрамікротомі, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солями урану, свинцю та інших металів, після чого переглядають у мікроскопі та фотографують. Отримані мікрофотографії є ​​об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.

2. Об'єкти дослідження гістології

3. Приготування гістологічних препаратів

4. Методи дослідження

5. Історичні етапи розвитку гістології

1. Гістологіянаука про мікроскопічну та субмікроскопічну будову, розвиток та життєдіяльність тканин тварин організмів. Отже, гістологія вивчає один із рівнів організації живої тканинної тканини. Розрізняють такі ієрархічні рівніорганізації живої матерії:

клітинний;

тканинний;

структурно-функціональні одиниці органів;

органний рівень;

системний рівень;

організмовий рівень

Гістологія як навчальна дисципліна, включає наступні розділи: цитологію, ембріологію, загальну гістологію (вивчає будову та функції тканин), приватну гістологію (вивчає мікроскопічну будову органів).

Основним об'єктомВивчення гістології є організм здорової людини і тому дана навчальна дисципліна називається як гістологія людини.

Основна задачагістології полягає у вивченні будови клітин, тканин, органів, встановлення зв'язків між різними явищами, встановлення загальних закономірностей.

Гістологія, як і анатомія, належить до морфологічних наук, головне завдання яких вивчення структур живих систем. На відміну від анатомії, гістологія вивчає будову живої матерії на мікроскопічному та електронно-мікроскопічному рівні. При цьому вивчення будови різних структурних елементів проводиться в даний час з урахуванням виконуваних ними функцій. Такий підхід до вивчення структур живої матерії називається гістофізіологічним, а гістологія нерідко називається як гістофізіологія.Крім того, при вивченні живої матерії на клітинному, тканинному і органному рівнях розглядається не тільки форма, розміри і розташування структур, що цікавлять, але методом цито-і гістохімії нерідко визначається і склад речовин, що утворюють ці структури. Нарешті, структури, що вивчаються, зазвичай розглядаються з урахуванням їх розвитку, як у внутрішньоутробному (ембріональному) періоді, так і протягом постембріонального онтогенезу. Саме з цим пов'язана необхідність включення ембріології до курсу гістології.

Гістологія, як будь-яка наука, має свої об'єкти та методиїх вивчення. Безпосередніми об'єктами вивчення є клітини, фрагменти тканин та органів, особливим способом приготовані для вивчення під мікроскопом.

2. Об'єкти дослідженняподіляються на:

живі (клітини у краплі крові, клітини у культурі та інші);

мертві або фіксовані, які можуть бути взяті від живого організму (біопсія), так і від трупів.

У будь-якому випадку після взяття шматочків вони піддаються дії фіксуючих розчинів або заморожування. І в наукових, і навчальних цілях використовуються фіксовані об'єкти. Приготовлені певним способом препарати, що використовуються для вивчення мікроскопом, називаються гістологічними препаратами.

Гістологічний препаратможе бути у вигляді:

тонкого забарвленого зрізу органу чи тканини;

мазка на склі;

відбитка на склі з розлому органу;

тонкого плівкового препарату.

Гістологічний препарат будь-якої форми повинен відповідати таким вимогам:

зберігати прижиттєвий стан структур;

бути досить тонким і прозорим для вивчення його під мікроскопом у світлі, що проходить;

бути контрастним, тобто структури, що вивчаються, повинні під мікроскопом чітко визначатися;

препарати для світлової мікроскопії повинні довго зберігатися та використовуватися для повторного вивчення.

Ці вимоги досягаються під час приготування препарату.

3. Виділяють такі етапи приготування гістологічного препарату

Взяття матеріалу(Шматочка тканини або органу) для приготування препарату. При цьому враховуються наступні моменти: забір матеріалу повинен проводитися якомога раніше після смерті або вибою тварини, а при можливості від живого об'єкта (біопсія), щоб краще збереглися структури клітини, тканини або органу; паркан шматочків повинен проводитися гострим інструментом, щоб не травмувати тканини; товщина шматочка не повинна перевищувати 5 мм, щоб фіксуючий розчин міг проникнути в товщу шматочка; обов'язково проводиться маркування шматочка (вказується найменування органу, номер тварини або прізвище людини, дата забору тощо).

Фіксація матеріалунеобхідна для зупинення обмінних процесів та збереження структур від розпаду. Фіксація досягається найчастіше зануренням шматочка в фіксуючі рідини, які можуть бути простими спиртами і формалінами і складними розчинами Карнуа, фіксатором Цинкера та іншими. Фіксатор викликає денатурацію білка і тим самим зупиняє обмінні процеси та зберігає структури у їхньому прижиттєвому стані. Фіксація може досягатися також заморожуванням (охолодженням у струмені СО2, рідким азотом та інші). Тривалість фіксації підбирається дослідним шляхом кожної тканини чи органа.

Заливання шматочків у ущільнюючі середовища(парафін, целоідин, смоли) або заморожування для подальшого виготовлення тонких зрізів.

Приготування зрізівна спеціальних приладах (мікротом або ультрамікротом) за допомогою спеціальних ножів. Зрізи для світлової мікроскопії приклеюються на предметне скло, а для електронної мікроскопії - монтуються на спеціальні сіточки.

Забарвлення зрізівабо їхнє контрастування (для електронної мікроскопії). Перед забарвленням зрізів видаляється ущільнююче середовище (депарафінізація). Забарвленням досягається контрастність досліджуваних структур. Барвники поділяються на основні, кислі та нейтральні. Найбільш широко використовуються основні барвники (зазвичай гематоксилін) та кислі (еозин). Нерідко використовують складні барвники.

Просвітлення зрізів(у ксилолі, толуолі), укладання в смоли (бальзам, полістерол), закриття покривним склом.

Після цих послідовно проведених процедур препарат може вивчати під світловим мікроскопом.

Для цілей електронної мікроскопіїв етапах приготування препаратів є деякі особливості, але загальні принципи самі. Головна відмінність полягає в тому, що гістологічний препарат для світлової мікроскопії може тривалий час зберігатися і багаторазово використовуватися. Зрізи для електронної мікроскопії використовуються одноразово. При цьому спочатку об'єкти препарату, що цікавлять, фотографуються, а вивчення структур проводиться вже на електронограмах.

З тканин рідкої консистенції(Кров, кістковий мозок та інші) виготовляються препарати у вигляді мазка на предметному склі, які також фіксуються, фарбуються, а потім вивчаються.

Зі ламких паренхіматозних органів(печінка, нирка та інші) виготовляються препарати у вигляді відбитка органу: після розлому або розриву органу, до місця розлому органу прикладається предметне скло, на яке приклеюються деякі вільні клітини. Потім препарат фіксується, фарбується та вивчається.

Зрештою, з деяких органів(брижа, м'яка мозкова оболонка) або з пухкої волокнистої сполучної тканини виготовляються плівкові препарати шляхом розтягування або роздавлювання між двома стеклами, також з наступною фіксацією, забарвленням та заливкою в смоли.

4. Основним методом дослідженнябіологічних об'єктів, що використовуються в гістології є мікроскопування, Т. е. вивчення гістологічних препаратів за мікроскопом. Мікроскопія може бути самостійним методом вивчення, але останнім часом вона зазвичай поєднується з іншими методами (гістохімії, гісторадіографії та інші). Слід пам'ятати, що для мікроскопії використовуються різні конструкції мікроскопів, що дозволяють вивчити різні параметри об'єктів, що вивчаються. Розрізняють такі види мікроскопії:

світлова мікроскопія (роздільна здатність 0,2 мкм) найбільш поширений вид мікроскопії;

ультрафіолетова мікроскопія (роздільна здатність 0,1 мкм);

люмінесцентна (флюоресцентна) мікроскопія для визначення хімічних речовин у структурах, що розглядаються;

фазово-контрастна мікроскопія для вивчення структур у незабарвлених гістологічних препаратів;

поляризаційна мікроскопія для вивчення, головним чином, волокнистих структур;

мікроскопія у темному полі для вивчення живих об'єктів;

мікроскопія в падаючому світлі вивчення товстих об'єктів;

електронна мікроскопія (роздільна здатність до 0,1-0,7 нм), два її різновиди просвічує (трансмісійна) електронна мікроскопія і скануюча або растрова мікроскопії дає відображення поверхні ультраструктур.

Гістохімічні та цитохімічні методидозволяє визначати склад хімічних речовин і навіть їх кількість у структурах, що вивчаються. Метод заснований на проведенні хімічних реакцій з реактивом і хімічними речовинами, що знаходяться в субстраті, з утворенням продукту реакції (контрастного або флюоресцентного), який потім визначається при світловій або люмінесцентній мікроскопії.

Метод гістоавторадіографіїдозволяє виявити склад хімічних речовин у структурах та інтенсивність обміну по включенню радіоактивних ізотопів до досліджуваних структур. Метод найчастіше використовується в експериментах на тваринах.

Метод диференціального центрифугуваннядозволяє вивчати окремі органели чи навіть фрагменти, виділені із клітини. Для цього шматочок досліджуваного органу розтирають, заливають фізіологічним розчином, а потім розганяють в центрифузі при різних обертах (від 2-х до 150 тис.) і отримують фракції, що цікавлять, які потім вивчають різними методами.

Метод інтерферометріїдозволяє визначити суху масу речовин у живих чи фіксованих об'єктах.

Імуноморфологічні методидозволяє за допомогою попередньо проведених імунних реакцій, на підставі взаємодії антиген-антитіло, визначати субпопуляції лімфоцитів, визначати ступінь чужорідності клітин, проводити гістологічне типування тканин та органів (визначати гістосумісність) для трансплантації органів.

Метод культури клітин(in vitro, in vivo) вирощування клітин у пробірці або в особливих капсулах в організмі та подальше вивчення живих клітин під мікроскопом.

Одиниці виміру, що використовуються в гістології

Для вимірювання структур у світловій мікроскопії використовуються переважно мікрометри: 1 мкм становить 0,001 мм; в електронній мікроскопії використовують нанометри: 1 нм становить 0,001 мкм.

5. У історії розвитку гістологіїумовно виділяють триперіоду:

Домікроскопічний період(з IV ст. до н. е. по 1665 р.) пов'язаний з іменами Аристотеля, Галена, Авіценни, Везалія, Фалопія і характеризується спробами виділення в організмі тварин і людини неоднорідних тканин (твердих, м'яких, рідких тощо) та використанням методів анатомічного препарування

Мікроскопічний період(З 1665 по 1950). Початок періоду пов'язують з ім'ям англійського фізика Роберта Гука, який, по-перше, удосконалив мікроскоп (вважають, що перші мікроскопи були винайдені на початку XVII ст.), по-друге, використав його для систематичного дослідження різних, у тому числі біологічних об'єктів і опублікував результати цих спостережень у 1665 р. у книзі "Мікрографія", по-третє, вперше ввів термін "клітина" ("целюля"). Надалі здійснювалося безперервне вдосконалення мікроскопів і дедалі ширше використання їх вивчення біологічних тканин і органів.

Особлива увага приділялася вивченню будови клітини. Ян Пуркіньє описав наявність у тварин клітинах "протоплазми" (цитоплазми) і ядра, а пізніше Р. Броун підтвердив наявність ядра і в більшості тварин клітин. Ботанік М. Шлейден зацікавився походженням клітин цитокенезисом. Результати цих досліджень дозволили Т. Швану на підставі їх повідомлень сформулювати клітинну теорію (1838-1839 рр.) у вигляді трьох постулатів:

всі рослинні та тваринні організми складаються з клітин;

всі клітини розвиваються за загальним принципом із цитобластеми;

кожна клітина має самостійну життєдіяльність, а життєдіяльність організму є сумою діяльності клітин.

Однак невдовзі Р. Вірхов (1858 р.) уточнив, що розвиток клітин здійснюється шляхом поділу вихідної клітини (будь-яка клітина з клітини). Розроблені Т. Шваном положення, клітинної теорії актуальні до нашого часу, хоча формулюється інакше.

Сучасні положення клітинної теорії:

клітка є найменшою одиницею живого;

клітини тварин організмів подібні за своєю будовою;

розмноження клітин відбувається шляхом поділу вихідної клітини;

Багатоклітинні організми являють собою складні ансамблі клітин та їх похідних, об'єднані в системи тканин та органів, пов'язані між собою клітинними, гуморальними та нервовими формами регуляції.

Подальше вдосконалення мікроскопів, особливо створення ахроматичних об'єктивів, дозволило виявити у клітинах дрібніші структури:

клітинний центр Гертвіг, 1875;

сітчастий апарат або пластинчастий комплекс Гольджі, 1898;

мітохондрії Бенда, 1898 р.

Сучасний етапрозвитку гістології починається з 1950 р. з початку використання електронного мікроскопа вивчення біологічних об'єктів, хоча електронний мікроскоп було винайдено раніше (Е. Руска, М. Кноль, 1931 р.). Однак для сучасного етапу розвитку гістології характерне впровадження не тільки електронного мікроскопа, але й інших методів: цито- та гістохімії, гісторадіографії та інших перерахованих вище сучасних методів. При цьому зазвичай використовується комплекс різноманітних методик, що дозволяє скласти не тільки якісне уявлення про структури, що вивчаються, але і отримати точні кількісні характеристики. Особливо широко нині використовуються різні морфометричні методики, зокрема автоматизовані системи обробки отриманої інформації з допомогою комп'ютерів.

Лекція 2. Цитологія. Цитоплазма

Злоякісні новоутворення - це група захворювань, що налічує кілька тисяч видів пухлин різних типів та різного ступеня злоякісності. Вони поділяються на великі групи залежно від того, з яких тканин вони розвиваються: якщо з епітеліальних (бар'єрних) — це раки, якщо з сполучних тканин (м'яких тканин і кісток) – саркоми, якщо з лімфоїдних (імунних) – лімфоми/лейкози. Від того, наскільки правильно верифікована пухлина (визначено її тип, ступінь злоякісності та інші характеристики), залежить правильність та ефективність лікування. Важливу роль цьому грають гістологічні дослідження .

Про те, як проходять гістологічні дослідження, які завдання, крім діагностичних, вони дозволяють вирішувати, що впливає на терміни їх виконання, розповідає завідувачка патологоанатомічного відділення з прозектурою НМІЦ онкології ім. Н.М. Петрова, к.м.н. Анна Сергіївна Артем'єва.

Що є матеріалом для патоморфологічних (гістологічних) досліджень?

Шматок тканини пацієнта: шкіри, слизових оболонок, внутрішніх органів, кісток, головного та спинного мозку тощо, так званий біоптат.

Процес отримання фрагмента тканини (біоптату) - біопсія - це кілька різних способів забору матеріалу для гістологічного дослідження.

Види біопсії:

• Пункційна біопсія – «тичок», тонкою або товстою голкою. Пункційні біоптати рідко мають діаметр більше 1-2 мм.
• Ножова біопсія – відкрита або ендоскопічна (малоінвазивна), у тому числі лапароторако-медіастиноскопія.

Біопсію внутрішніх органів роблять під УЗД-навігацією або за допомогою хірургічного втручання.

Операційний матеріал – це все, що видалено під час операції, як правило, орган або його частина, або кілька органів та/або їх частин з утворенням (пухлиною) або без нього.

Як обробляють ці матеріали щодо гістологічного дослідження?

1 етап.Фіксація - "консервування" біоптату у формаліні - спеціальному хімічному розчині, який запобігає гниття, дозволяє зберегти структури тканини.

Фіксація біоптату може тривати від 6 до 24 годин – залежно від його виду та розміру.

Операційний матеріал фіксується довше, кілька етапів. Спочатку попередня фіксація, що займає приблизно 12 годин. Потім вирізка потрібних фрагментів та повторна фіксація ще 24 години.

Співвідношення обсягу матеріалу до обсягу формаліну має бути 1:20.

Час фіксації скоротити не можна!

2 Етап.Процесинг - процес зневоднення, знежирення та просочення матеріалу парафіном. Автомат переміщає шматочок матеріалу з розчину розчин.

Як розчини застосовуються: абсолютований ізопропіловий спирт (6-8 змін), ксилол (2 зміни), розплавлений парафін (2 зміни).

Програма відрізняється для «жирного» матеріалу (до яких відносяться, наприклад, тканини молочної залози) та «нежирного» – 36 та 24 години відповідно.

Процес одержання парафінових блоків.

3 Етап.Виготовлення парафінового блоку. Шматок матеріалу міститься у форму з розплавленим парафіном (вже іншим, ніж під час процесингу – з вищою температурою плавлення) і охолоджується. Виконується вручну, важко прискорити.

Мікротомія

4 Етап.Виготовлення зрізів. Товщина зразка – шматочка тканини, залитої у парафін – 1-3 мм. Товщина кожного зрізу 4-5 мкм (0,004-0,005 мм). Виконує лаборант із використанням спеціального інструменту – мікротома.

Зрізи монтуються на скло і повинні висохнути.

Незважаючи на те, що частина матеріалу втрачається при вирівнюванні в мікротомі, при належному професіоналізмі, з одного зразка - матеріалу від однієї біопсії, операційного матеріалу від однієї пухлини, можна виготовити близько 100 стекол (мікропрепаратів).

Навіщо робляться зрізи?

Зрізи робляться для рутинного забарвлення гематоксилінном та еозином, імуногістохімічного дослідження та інших видів досліджень.

Зрізи для всіх досліджень використовуються однакові, розрізняється забарвлення, можуть відрізнятися шибки, на які вони монтуються, так для ІГХ і FISH потрібні спеціальні адгезивні шибки або заряджені шибки.

Гістостнер

Блоки та скла здатні зберігатися довгі роки та використовуватися для проведення додаткових гістологічних досліджень, переглядів, а також у наукових цілях.

Архів

Архів гістологічних матеріалів збирається у НМІЦ онкології ім. Н.М. Петрова з 1927 року містить більше 10 млн одиниць зберігання (мікропрепарати — скла, парафінові блоки, архівні картки, вологий архів).

Які види гістологічних досліджень є найбільш інформативними?

• Гістологічне дослідження
• Імуногістохімія (ІГХ)
• Флуоресцентна гібридизація in situ (FISH), може бути хромофобною (принцип той самий, інший тип мітки)

Що дозволяють визначити різні види гістологічних досліджень

Гістологічне дослідження – що це таке?

Дозволяє верифікувати пухлину - тобто визначити з яких клітин вона складається (з якої тканини вона розвивається), ступінь її диференціювання (зрілості).

Рутинне фарбування, що виконується при гістологічному дослідженні, дозволяє виявити патологічний процес в аналізованому матеріалі (біоптаті, операційному матеріалі):

• запалення,
• специфічне запалення,
• аномалія розвитку,
• пухлина.

Також, в більшості випадків, завдяки рутинному забарвленню, можна визначити ступінь злоякісності пухлини і якщо вона досить зріла, то яка її природа.

Пофарбовані зрізи під мікроскопом

Інвазивний протоковий рак 100%.	Карцинома сигмовидної кишки.
Великоклітинна нейроендокринна пухлина.	МТС великоклітинної нейроендокринної пухлини.
Неспецифічний рак молочної залози. Ділянка in situ карциноми усередині протоки, кріброзного типу.	Низькодиференційований рак стравоходу.

При гістологічному дослідженні біоптату та операційного матеріалу можна оцінити поширеність: розмір пухлини та проростання в навколишні тканини, наскільки торкнулися лімфовузли і чи є метастази у віддалені органи (якщо всі ці структури надіслані для гістологічного дослідження). При консультації готових мікропрепаратів – скла, це, як правило, неможливо, якщо пухлина більша за розміри гістологічної касети або розсічена попереднім дослідником і не надано дані макроскопічного дослідження.

Під час гістологічного дослідження вивчаються всі шибки від одного зразка – матеріалу, отриманого від одного втручання – однієї операції чи однієї біопсії, незалежно від їх кількості, це вважається однією консультацією.

Терміни виконання гістологічного дослідження залежать від кількості мікропрепаратів та від категорії складності того процесу, який у них виявляється, терміни можуть подовжуватися, особливо за необхідності використання додаткових методів дослідження та аналізу додаткових відомостей. На терміни виконання гістологічного дослідження впливає повнота наданої пацієнтом клінічної інформації, зокрема даних вже проведених досліджень.

Імуногістохімія (ІГХ)

Складне багатоетапне дослідження виконується після гістологічного дослідження на тому ж матеріалі. Пухлинні зрізи забарвлюються антитілами, які здатні зв'язуватися антигенами (білками), які несуть пухлинні клітини. Різні пухлинні клітини несуть різні антигени, до кожного з яких подібно до ключа до замку підходить антитіло.

Один із етапів ІДГ

ІГХ дослідження – це комбінаторика. 100% специфічних і чутливих до якоїсь пухлини маркерів не існує, але є набір антигенів, які у певному типі пухлини повинні бути і набір тих, яких там бути не повинно, таким чином ІГХ-панель будується так, щоб включати кілька антитіл, які мають бути позитивними і кілька, які мають бути негативними. Для різних пухлин розрізняються ці набори позитивних/негативних маркерів.

При проведенні прогностичної ІГХ – виявлення маркерів чутливості до терапії визначається набір таких маркерів для конкретних пухлин, наприклад, раку молочної залози: рецептори стероїдних гормонів (естроген, прогестерон), рецептор епідермального фактора росту (HER2) та індекс проліферативної активності Ki67 (швидкості) .

Скло фарбується послідовно - різними антитілами фарбуються набори маркерів у кілька етапів, процес фарбування скла одним антитілом займає 48 годин.

Таким чином, кожне антитіло наноситься на окремий зріз тканини, монтований на окреме скло, як правило з відповідним зовнішнім контролем, кількість реакцій (використовуваних антитіл) та етапів фарбування може суттєво варіювати в залежності від конкретної діагностичної ситуації, все залежить від індивідуальних особливостей пухлини. Проводиться така кількість забарвлень, яка потрібна для того, щоб виявити найбільш характерний для певної пухлини набір позитивних і негативних маркерів.

Комусь для цього буде достатньо 5 антитіл, а комусь необхідно зробити 20 і більше забарвлень. Максимальна кількість забарвлень, яку нам доводилося робити, – 212.

Тому точні терміни та вартість цього дослідження неможливо визначити заздалегідь. Різні за течією та прогнозом пухлини можуть бути дуже схожі одна на одну, тільки мінімальні відмінності у фарбуванні, з урахуванням клінічних даних та даних інших методів обстеження, можуть дозволити встановити правильний діагноз.

Є цілий ряд доброякісних пухлин, що симулюють злоякісні, зокрема високоагресивні, а деякі злоякісні високодиференційовані пухлини важко від запальних і реактивних процесів. У таких ситуаціях лише досвід та кваліфікація патоморфолога, аналіз всього комплексу доступної інформації (знімки КТ, МРТ, рентген, протокол операції та ін.) дозволяють поставити діагноз.

У грамотній інтерпретації результатів ІДГ дуже важлива роль експерта, адже ті випадки, з якими доводиться працювати, здебільшого складні. Практично не існує антитіл, які можуть виступати в якості 100% маркерів тієї чи іншої пухлини, лікаря завжди доводиться зважувати різні ймовірності.

Що визначається за допомогою ІДГ?

• Наявність рецепторів гормонів прогестерону та естрогену при раку молочної залози;
• Експресію HER-2/neu в клітинах при раку молочної залози, раку шлунка;
• Визначити ходжкінські та неходжкінські лімфоми — встановити точний діагноз лімфоми на сьогоднішній день неможливо без застосування цього виду дослідження.
• Визначити первинна пухлина або метастази, тканинну приналежність метастазів.

Імуногістохімія дозволяє оцінити потенційний темп зростання пухлини, відповідь на хіміо-, таргетну, гормональну терапію.

Флуоресцентна гібридизація in situ (FISH-тест)

Це метод молекулярно-генетичної діагностики у тканині.

FISH проводиться у зрізі тканини та дозволяє прив'язати генетичну перебудову до конкретної пухлинної клітини.

У цьому тесті також використовуються спеціальні барвники, які зв'язуються лише з певними ділянками хромосом. Їх називають зондами, які можуть бути позначені флуоресцентним або хромогенним барвником, що візуалізуються за допомогою флуоресцентного або світлового мікроскопа.

Технічні операції з підготовки гістологічного скла до цього дослідження займає 2 робочі дні.

Аналіз препарату з допомогою багатоголового мікроскопа.

Отримані мікропрепарати дуже чутливі до зовнішнього середовища - вони можуть вицвісти з часом, щоб уникнути втрат інформації всі FISH-препарати скануються, створюється їхня цифрова копія, яка доступна для зовнішнього перегляду. Фахівці переглядають флуоресцентний матеріал у темному полі, в аналізі препарату беруть участь як мінімум 2 спеціалісти. За потреби використовується і цифровий аналіз.

Що визначається за допомогою FISH-тесту?

FISH-тест дозволять діагностувати деякі види пухлин, що визначає доцільність використання деяких хіміотерапевтичних препаратів.

• визначається наявність ампліфікації HER2 у випадках прикордонного результату за даними ІГХ, що необхідне призначення таргетної терапії;
• проводиться діагностика, тобто виявлення генетичних перебудов специфічних для певного типу пухлин, коли неможливо остаточно встановити діагноз за допомогою більш простих методик, найчастіше це саркоми м'яких тканин та пухлини головного мозку;
• генетичні відхилення, що викликають рак того чи іншого органу;
• при лімфомах ця методика використовується в діагностичних цілях та для виявлення факторів несприятливого прогнозу, тобто показань для ранньої інтенсифікації лікування.

Проведення гістологічного дослідження, і насамперед FISH-тесту, — це експертна робота, яка залежить від кваліфікації спеціаліста. Дуже багато мутацій, які виявляються в пухлинах, не завжди є мітками пухлин, вони можуть перебувати і в доброякісних утвореннях або нормальних тканинах.

За рік патологоанатомічне відділення НМІЦ онкології імені М.М. Петрова виконує близько 20000 гістологічних досліджень (пацієнтів), з них близько 5000 консультативних випадків (переглядів), понад 30000 ІГХ досліджень, а також бере участь у програмі зовнішнього контролю якості ІГХ досліджень NordIQ.

Фахівці відділення мають величезний досвід проведення гістологічних досліджень та експертних компетенцій.

Пам'ятайте! Гістологічні дослідження – це відправна точка, від того, наскільки грамотно вони виконані, залежить точність поставленого діагнозу та ефективність призначеного лікування.

Швидкість виконання гістологічних досліджень та адекватність гістологічного висновку залежать від низки факторів:

• Якості стекол та блоків;
• Комплектності надання скла (необхідно надати всі шибки та блоки);
• Надання пацієнтом додаткової інформації, яка допоможе правильно інтерпретувати дані гістологічного дослідження, ІГХ та FISH-тесту, а саме: дані анамнезу захворювання, дані про супутні захворювання, в першу чергу інфекційні (ВІЛ, гепатити); всі дані всіх проведених обстежень та втручань: знімки – рентген, КТ, МРТ, УЗД, протоколи операцій, виписки.

Після виконання гістологічного дослідження пацієнт отримує гістологічне висновок/протокол дослідження гістологічного матеріалу.

Розшифровка гістологічного дослідження: навіщо звернути увагу?

Гістологічний висновок включає кілька рубрик (полів):

Макроскопічний опис

Заповнюється як для біоптатів - не обов'язково, так і для операційного матеріалу, для якого має вкрай важливе значення у ряді випадків.

Мікроскопічний опис

Опис змін на мікроскопічному рівні не обов'язково до заповнення, так як вся необхідна інформація може бути відображена в полі «висновок».

Результати імуногістохімічного дослідження

У цьому полі описано які антитіла використовувалися в даному випадку і який результат фарбування: наявність фарбування або його відсутність, локалізація в клітині при необхідності, а також відсоток позитивних клітин та інтенсивність реакції, коли це має значення.

Патологоанатомічний висновок

Містить нозологічну/класифікаційну одиницю, якщо її можна встановити за дослідженим матеріалом, тобто дає відповіді на запитання:

• Це первинна пухлина чи метастаз?
• Де локалізовано первинне пухлинне вогнище?
• Який гістологічний тип пухлини (із клітин якого типу вона складається)?

Також наводяться всі необхідні прогностичні дані: ступінь диференціювання, параметри, що впливають на стадію, стан країв резекції, якщо їх можна оцінити і т.п.

Поле може містити коментарі щодо можливого напряму подальшого обстеження, ймовірності того чи іншого діагнозу, необхідності ознайомитися з тими чи іншими клінічними даними та ін.

Ми не рекомендуємо пацієнтам самостійно займатися розшифровкою показників гістологічного дослідження, використовуючи інформацію, отриману на різних Інтернет-сайтах та форумах пацієнтів, оскільки на інтерпретацію даних впливає велика кількість факторів, у тому числі вік пацієнта, дані інших досліджень та ін.

Розшифровкою дослідження може займатися лише фахівець – лікар онколог із профілю захворювання!

Що вам потрібно зробити

1. Якщо ви хочете дізнатися більше про безкоштовні можливості ФБГУ НМІЦ онкології ім. Н.М. Петрова МОЗ Росії, отримати очну або заочну консультацію з діагностики та лікування, записатися на прийом, ознайомтеся з інформацією на офіційному сайті.
2. Якщо ви хочете спілкуватися з нами через соціальні мережі, зверніть увагу на облікові записи в

Глава 2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ У ГІСТОЛОГІЇ, ЦИТОЛОГІЇ ТА ЕМБРІОЛОГІЇ

Глава 2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ У ГІСТОЛОГІЇ, ЦИТОЛОГІЇ ТА ЕМБРІОЛОГІЇ

Для прогресу гістології, цитології та ембріології велике значення має впровадження досягнень фізики та хімії, нових методів суміжних наук – біохімії, молекулярної біології, генної інженерії.

Сучасні методи дослідження не лише дозволяють вивчати тканини як єдине ціле, але й виділяти з них окремі типи клітин для вивчення їх життєдіяльності протягом тривалого часу, виділяти окремі клітинні органели та складові їх макромолекули (наприклад, молекули дезоксирибонуклеїнової кислоти – ДНК), досліджувати їх функціональні особливості.

Такі можливості відкрилися у зв'язку зі створенням нових приладів та технологій - різних типів мікроскопів, комп'ютерної техніки, рентгеноструктурного аналізу, застосування методу ядерно-магнітного резонансу (ЯМР), радіоактивних ізотопів та авторадіографії, електрофорезу та хроматографії, фракціонування клітинного вмісту за допомогою ультрацентрифугів. поділу та культивування клітин, отримання гібридів; використання біотехнологічних методів - отримання гібридом та моноклональних антитіл, рекомбінантних ДНК та ін.

Таким чином, біологічні об'єкти можна вивчати на тканинному, клітинному, субклітинному та молекулярному рівнях. Незважаючи на впровадження в природничі науки різноманітних біохімічних, біофізичних, фізичних та технологічних методів, необхідних для вирішення багатьох питань, пов'язаних із життєдіяльністю клітин та тканин, гістологія у своїй основі залишається морфологічною наукоюіз властивим їй набором методів. Останні дозволяють охарактеризувати процеси, що відбуваються у клітинах та тканинах, їх структурні особливості.

Головними етапами цитологічного та гістологічного аналізу є вибір об'єкта дослідження, його підготовка для вивчення під мікроскопом, якісний та кількісний аналіз зображень гістологічних елементів.

Об'єктами дослідження служать живі та фіксовані клітини та тканини, їх зображення, отримані при використанні світлових та елек-

мікроскопів або на екрані дисплея. Існує низка методів, що дозволяють проводити аналіз зазначених об'єктів.

2.1. МЕТОДИ МІКРОСКОПЮВАННЯ ГІСТОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ

Основним методом вивчення біологічних мікрооб'єктів є світлова та електронна мікроскопія, які широко використовуються в експериментальній та клінічній практиці.

Мікроскопіювання - головний метод вивчення мікрооб'єктів, що використовується в біології понад 300 років. Для вивчення гістологічних препаратів застосовують різноманітні види світлових мікроскопів та електронні мікроскопи. З моменту створення та застосування перших мікроскопів вони постійно вдосконалювалися. Сучасні мікроскопи є складними оптичними системами, що мають високу роздільну здатність. Розмір найменшої структури, яку можна бачити за допомогою мікроскопа, визначається найменшою роздільною здатністю (d), яка в основному залежить від довжини хвилі світла (λ) і довжини хвиль електромагнітних коливань потоку електронів та ін. Ця залежність наближено визначається формулою d= λ/2. Таким чином, чим менша довжина хвилі, тим менша відстань, і тим менші за розмірами мікроструктури можна бачити в препараті.

Світлова мікроскопія.Для вивчення гістологічних мікрооб'єктів застосовують звичайні світлові мікроскопи та їх різновиди, у яких використовуються джерела світла із хвилями різної довжини. У звичайних світлових мікроскопах джерелом освітлення є природне або штучне світло (рис. 2.1). Мінімальна довжина хвилі видимої частини діапазону приблизно 0,4 мкм. Отже, для звичайного світлового мікроскопа найменша відстань приблизно становить 0,2 мкм, а загальне збільшення (твір збільшення об'єктиву на збільшення окуляра) може бути 1500-2500.

Таким чином, за допомогою світлового мікроскопа можна побачити не лише окремі клітини розміром від 4 до 150 мкм, а й їх внутрішньоклітинні структури – органели, включення. Для посилення контрастності мікрооб'єктів застосовують їхнє фарбування.

Ультрафіолетова мікроскопія.Це різновид світлової мікроскопії. В ультрафіолетовому мікроскопі використовують короткі ультрафіолетові промені з довжиною хвилі близько 0,2 мкм. Відстань, що дозволяється тут у 2 рази менше, ніж у звичайних світлових мікроскопах, і становить приблизно 0,1 мкм. Отримане в ультрафіолетових променях невидиме оком зображення перетворюється на видиме за допомогою реєстрації на фотопластинці або шляхом застосування спеціальних пристроїв (люмінесцентний екран, електронно-оптичний перетворювач).

Флюоресцентна (люмінесцентна) мікроскопія.Явлення флюоресценції полягають у тому, що атоми та молекули ряду речовин, поглинаючи коротко-

Мал. 2.1.Мікроскопи для біологічних досліджень:

а- світловий біологічний мікроскоп «Біолам-С»: 1 – основа; 2 - ту-бусоутримувач; 3 – похилий тубус; 4 – окуляр; 5 – револьвер; 6 – об'єктиви; 7 – столик; 8 - конденсор з ірисовою діафрагмою; 9 - гвинт конденсора; 10 – дзеркало; 11 - мікрометричний гвинт; 12 - макрометричний гвинт; б- електронний мікроскоп ЕМВ-100АК з автоматизованою системою обробки зображень: 1 - колонка мікроскопа (з електронно-оптичною системою та камерою для зразків); 2 – пульт управління; 3 – камера з люмінесцентним екраном; 4 – блок аналізу зображень; 5 - датчик відеосигналу; в- конфокальний мікроскоп: 1 – світловий мікроскоп; 2 - реєстратор зображення (фотоелектронний помножувач);

3 - пристрій для переміщення світлового променя по осі X, Y, Z;

4 - блок живлення та стійка управління лазерами; 5 - комп'ютер для обробки зображень

хвильові промені, переходять у збуджений стан. Зворотний перехід із збудженого стану в нормальний відбувається з випромінюванням світла, але з більшою довжиною хвилі. У флюоресцентному мікроскопі як джерела світла для збудження флюоресценції застосовують ртутні або ксенонові лампи надвисокого тиску, що володіють високою яскравістю в області спектру 0,25-0,4 мкм (ближні ультрафіолетові промені) і 0,4-0,5 мкм (си -фіолетові промені). Довжина світлової хвилі флюоресценції завжди більша за довжину хвилі збудливого світла, тому їх розділяють за допомогою світлофільтрів і вивчають зображення об'єкта тільки у світлі флюоресценції. Розрізняють власну, чи первинну, і наведену, чи вторинну, флюоресценцію. Будь-яка клітина живого організму має власну флюоресценцію, проте вона часто буває надзвичайно слабкою.

Первинна флюоресценція має серотонін, катехоламіни (адреналін, норадреналін), що містяться в нервових, опасистих та інших клітинах, після фіксації тканин у парах формальдегіду при 60-80 °С (метод Фалька).

Вторинна флюоресценція виникає під час обробки препаратів спеціальними барвниками - флюорохромами.

Існують різні флюорохроми, які специфічно зв'язуються з певними макромолекулами (акридиновий помаранчевий, родамін, флюоресцеїн та ін.). Наприклад, при обробці препаратів акридиновим помаранчевим ДНК та її сполуки у клітинах мають яскраво-зелене, а РНК та її похідні – яскраво-червоне світіння. Існує багато барвників, за допомогою яких можна виявити білки, ліпіди, внутрішньоклітинні іони кальцію, магнію, натрію та ін. Таким чином, спектральний склад випромінювання несе інформацію про внутрішню будову об'єкта та його хімічний склад. Варіант методу флюоресцентної мікроскопії, при якому і збудження, і випромінювання флюоресценції відбуваються в ультрафіолетовій області спектра, отримав назву методу флюоресцентної ультрафіолетової мікроскопії.

Для підвищення контрастності флюорохромованих об'єктів застосовується конфокальний варіантоптичного мікроскопа (див. рис. 2.1, в). Як висвітлення використовується пучок монохроматичного світла малого діаметра, який створює лазерне джерело. У кожний момент часу у фокусі мікроскопа знаходиться невелика ділянка (об'єм) клітини. Пучок світла переміщається об'єктом (сканує об'єкт по осях X, Y, Z).При кожному переміщенні пучка світла однією з ліній сканування виходить інформація про досліджувану структуру, що знаходиться в даній точці (обсязі) по лінії сканування (оптичному зрізі клітини), наприклад про локалізації білків у складі мікротрубочок в клітині. Вся інформація від кожної точки сканування клітини передається на комп'ютер, об'єднується за допомогою спеціальної програми і видається на екран монітора у вигляді контрастного зображення. За допомогою даного методу мікроскопії виходить інформація про форму клітин, цитоскелі, структуру ядра, хромосом та ін. За допомогою програми комп'ютер на основі отриманої інформації по кожній лінії сканування створює об'ємне зображення клітини, що дозволяє розглядати клітину під різними кутами зору.

Фазово-контрастна мікроскопія.Цей метод служить отримання контрастних зображень прозорих і безбарвних живих об'єктів, невидимих ​​при звичайних методах мікроскопування. Метод заснований на тому, що світло, проходячи структури з різним коефіцієнтом спотворення, змінює свою швидкість. Використовувана конструкція оптики мікроскопа дає можливість перетворити не сприймаються оком фазові зміни світла, що пройшов через незабарвлений препарат, в зміни його амплітуди, тобто яскравості одержуваного зображення. Метод фазового розмаїття забезпечує контрастність досліджуваних незабарвлених структур за рахунок спеціальної кільцевої діафрагми, що міститься в конденсорі, і так званої фазової пластинки, що знаходиться в об'єктиві. Різновидом методу фазового розмаїття є метод фазово-темнопольного розмаїття, що дає негативне в порівнянні з позитивним фазовим контрастом зображення.

Мікроскопія у темному полі.У темнопольному мікроскопі лише світло, яке дає дифракцію (обгинання хвилями) структур у препараті, досягає об'єктиву. Відбувається це завдяки наявності у мікроскопі спеціального конденсора, який висвітлює препарат суворо косим світлом; промені від освітлювача прямують збоку. Таким чином, поле виглядає темним, а дрібні частки в препараті відбивають світло, яке далі потрапляє до об'єктиву. У клініці цей метод застосовують для вивчення кристалів у сечі (сечова кислота, оксалати), для демонстрації спірохет, зокрема Treponema pallidum,викликає сифіліс, та ін.

Інтерференційна мікроскопія.Різновидами фазово-контрастного мікроскопа є інтерференційний мікроскоп, призначений для кількісного визначення маси тканини. Диференціальний інтерференційний мікроскоп (з оптикою Номарського) використовують із вивчення рельєфу поверхні клітин та інших біологічних об'єктів.

В інтерференційному мікроскопі пучок світла від освітлювача поділяється на два потоки: один проходить через об'єкт і змінюється фазою коливання, другий йде, минаючи об'єкт. У призмах об'єктиву обидва пучки накладаються один на одного. В результаті будується зображення, в якому ділянки мікрооб'єкта різної товщини та щільності розрізняються за рівнем контрастності. Провівши кількісну оцінку змін, визначають концентрацію та масу сухої речовини.

Фазово-контрастний та інтерференційний мікроскопи дозволяють вивчати живі клітини.Вони використовують інтерференція, що виникає при комбінації двох наборів хвиль і створює зображення мікроструктур. Перевагою фазово-контрастної, інтерференційної та темно-польової мікроскопії є можливість спостерігати клітини у процесі руху та мітозу. При цьому реєстрація руху клітин може проводитись за допомогою цейтраферної (покадрової) мікровідеозйомки.

Поляризаційна мікроскопія.Поляризаційний мікроскоп є модифікацією світлового мікроскопа, в якому встановлено два поляризаційні фільтри: перший (поляризатор) - між пучком світла та об'єктом, а другий (аналізатор) - між лінзою об'єктива та оком. Через перший фільтр світло проходить тільки в одному напрямку, другий фільтр має головну вісь,

яка розташовується перпендикулярно до першого фільтра, і він не пропускає світло. Виходить ефект темного поля. Структури, що містять подовжньо орієнтовані молекули (колаген, мікротрубочки, мікрофіламенти), і кристалічні структури, мають властивість обертати вісь світлових променів, що виходять з поляризатора. При зміні осі обертання ці структури виявляються як світяться на темному тлі. Здатність кристалів або паракристалічних утворень до роздвоєння світлової хвилі на звичайну і перпендикулярну до неї називається подвійним променезаломленням. Таку здатність мають фібрили поперечносмугастих м'язів.

Електронна мікроскопіяВеликим кроком уперед у розвитку техніки мікроскопії було створення та застосування електронного мікроскопа (див. рис. 2.1). В електронному мікроскопі використовується потік електронів з короткими хвилями, ніж у світловому мікроскопі. При напрузі 50 000 довжина хвилі електромагнітних коливань, що виникають при русі потоку електронів у вакуумі, дорівнює 0,0056 нм. Теоретично розраховано, що відстань у цих умовах може бути близько 0,002 нм, або 0,000002 мкм, тобто в 100 000 разів менше, ніж у світловому мікроскопі. Практично в сучасних електронних мікроскопах роздільна здатність становить близько 0,1-0,7 нм.

У гістології використовуються трансмісійні (просвічують) електронні мікроскопи (ТЕМ), скануючі (растрові) електронні мікроскопи (СЕМ) та їх модифікації. За допомогою ТЕМ можна отримати лише площинне зображення мікрооб'єкта, що вивчається. Для отримання просторового ставлення до структур застосовують СЕМ, здатні створювати тривимірне зображення. Растровий електронний мікроскоп працює за принципом сканування електронним мікрозондом об'єкта, що досліджується, тобто послідовно «обмацує» гостро сфокусованим електронним пучком окремі точки поверхні. Таке дослідження об'єкта називається скануванням(зчитуванням), а малюнок, яким рухається мікрозонд, - растром.Отримане зображення виводиться на екран, електронний промінь якого рухається синхронно з мікрозондом.

Головними перевагами растрової електронної мікроскопії є велика глибина різкості, широкий діапазон безперервної зміни збільшення (від десятків до десятків тисяч разів) і висока роздільна здатність. Сучасними варіантами приладів вивчення поверхні об'єкта є атомно-силовой мікроскоп і скануючий тунельний мікроскоп.

Електронна мікроскопія з використанням методу заморожування- сколюваннязастосовується вивчення деталей будови мембран і міжклітинних сполук. Для виготовлення сколів клітини заморожують за низької температури (-160 °С). При дослідженні мембрани площина сколу проходить через середину бислоя ліпідів. Далі на внутрішні поверхні отриманих половинок мембран напилюють метали (платина, паладій, уран), вивчають їх за допомогою ТЕМ та мікрофотографії.

Метод кріоелектронної мікроскопії.Швидко заморожений тонкий шар (близько 100 нм) зразка тканини поміщають на мікроскопічні ґрати та досліджують у вакуумі мікроскопа при -160 °С.

Метод електронної мікроскопії «заморожування – травлення»застосовують вивчення зовнішньої поверхні мембран клітин. Після швидкого заморожування клітин за дуже низької температури блок розколюють лезом ножа. Кристали льоду, що утворюються, видаляють шляхом сублімації води у вакуумі. Потім ділянки клітин відтіняють, напилюючи тонку плівку важкого металу (наприклад, платини). Метод дозволяє виявляти тривимірну організацію структур.

Таким чином, методи заморожування - сколювання та заморожування - травлення дозволяють вивчати нефіксовані клітини без утворення в них артефактів, що викликаються фіксацією.

Методи контрастування солями важких металів дозволяють досліджувати в електронному мікроскопі окремі макромолекули – ДНК, великих білків (наприклад, міозин). При негативному контрастуванні вивчають агрегати макромолекул (рибосоми, віруси) чи білкові филаменты (актинові нитки).

Електронна мікроскопія ультратонких зрізів, отриманих методом кріоультрамікротомії.При цьому методі шматочки тканин без фіксації та заливання у тверді середовища швидко охолоджують у рідкому азоті при температурі -196 °С. Це забезпечує гальмування метаболічних процесів клітин та перехід води з рідкої фази у тверду. Далі блоки ріжуть на ультрамікротомі за низької температури. Такий метод приготування зрізів зазвичай використовують визначення активності ферментів, і навіть щодо імунохімічних реакцій. Для виявлення антигенів застосовують антитіла, пов'язані з частинками колоїдного золота, локалізацію якого легко виявити препаратах.

Методи надвисоковольтної мікроскопії.Використовують електронні мікроскопи з прискорюючою напругою до 3 000 000 В. Перевага цих мікроскопів у тому, що вони дозволяють досліджувати об'єкти великої товщини (1-10 мкм), так як за високої енергії електронів вони менше поглинаються об'єктом. Стереоскопічна зйомка дозволяє отримувати інформацію про тривимірну організацію внутрішньоклітинних структур з високою роздільною здатністю (близько 0,5 нм).

2.2. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ФІКСОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН

Основним об'єктом дослідження є гістологічні препарати, виготовлені з фіксованих тканин та органів. Препарат може являти собою мазок(наприклад, мазок крові, кісткового мозку, слини, цереброспінальної рідини та ін.), відбиток(наприклад, селезінки, тимусу, печінки), плівкуз тканини (наприклад, очеревини, плеври, м'якої оболонки мозку), тонкий зріз.Гістологічні препарати можуть вивчатися без спеціальної обробки, наприклад із застосуванням фазово-контрастного мікроскопа. Найбільш часто для світлової мікроскопії використовуються зрізи тканини або органа з подальшим їх забарвленням.

Процес виготовлення гістологічного препарату для світлової та електронної мікроскопії включає такі основні етапи: 1) взяття матеріалу та його фіксація; 2) ущільнення матеріалу; 3) приготування зрізів; 4) фарбування чи контрастування зрізів. Для світлової мікроскопії необхідний ще один етап - укладання зрізів у бальзам чи інші

прозорі середовища (5). Фіксаціязабезпечує запобігання процесам розкладання, що сприяє збереженню цілісності структур. Це досягається тим, що взятий з органу невеликий зразок або занурюють у фіксатор (спирт, формалін, розчини солей важких металів, осмієва кислота, спеціальні фіксуючі суміші), або піддають термічній обробці. Під впливом фіксатора у тканинах і органах відбувається незворотна коагуляція білків, внаслідок якої життєдіяльність припиняється, а структури стають мертвими, фіксованими.

Ущільненняшматочків, необхідне для приготування зрізів, виробляється шляхом зневоднення спиртами зростаючої концентрації та просочування парафіном, целоїдином, органічними смолами. Швидше ущільнення досягається застосуванням методу заморожування шматочків, наприклад, в рідкій вуглекислоті.

Приготування зрізіввиробляється за допомогою спеціальних приладів - мікротомів та заморожуючих мікротомів, або кріостатів (для світлової мікроскопії) та ультрамікротомів (для електронної мікроскопії). Товщина зрізу для світлооптичного дослідження коливається від 5 до 20 мкм, а для електронної мікроскопії – від 40 до 100 нм. Для порівняння 1 мм дорівнює 1000 мкм та 1 000 000 нм.

Фарбування зрізів(для світлової мікроскопії) або напилення їх солями металів (для електронної мікроскопії) застосовують збільшення контрастності зображення окремих структур. Методи забарвлення гістологічних структур дуже різноманітні та вибираються залежно від завдань дослідження. Гістологічні барвники поділяють на кислі, основні та нейтральні. Як приклад можна навести найбільш відомий основний барвник гематоксилін, який забарвлює ядра у фіолетовий колір, і кислий барвник - еозин, що забарвлює цитоплазму в рожево-жовтогарячий колір. Виборча спорідненість структур до певних барвників зумовлена ​​їх хімічним складом та фізичними властивостями. Структури, що добре фарбуються кислими барвниками, називаються оксифільними(ацидофільними, еозинофільними), а основними, що фарбуються - базофільними.Структури, що сприймають як кислі, так і основні барвники, є нейтрофільними(Гетерофільними). Існують структури клітини, які забарвлюються в колір, відмінний від кольору барвника, що використовується. Це явище називається метахромазії.Забарвлені препарати зазвичай зневоднюють у спиртах зростаючої міцності і просвітлюють у ксилолі, бензолі, толуолі або деяких оліях. Для тривалого збереження зневоднений гістологічний зріз укладають між предметним та покривним склом у канадський бальзам або інші речовини. Готовий гістологічний препарат можна використовувати для вивчення під мікроскопом протягом багатьох років. Для електронної мікроскопії зрізи, отримані за допомогою ультрамікротома, поміщають на спеціальні сітки, контрастують солі свинцю, кобальту, після чого переглядають в мікроскопі і фотографують. Отримані мікрофотографії є ​​об'єктом вивчення поряд з гістологічними препаратами.

2.3. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ЖИВИХ КЛІТИН

І ТКАНИНЬ

Вивчення живих клітин та тканин дозволяє отримати найбільш повну інформацію про їхню життєдіяльність - простежити рух, процеси поділу, руйнування, зростання, диференціювання та взаємодії клітин, тривалість їх життєвого циклу, реактивні зміни у відповідь на дію різних факторів.

Прижиттєві дослідження клітин в організмі (In vivo). Одним із прижиттєвих методів дослідження є спостереження структур у живому організмі. За допомогою спеціальних мікроскопів-ілюмінаторів, що просвічують, наприклад, можна вивчати в динаміці циркуляцію крові в мікросудинах. Після проведення анестезії у тварини об'єкт дослідження (наприклад, брижа кишки) виводять назовні та розглядають за допомогою мікроскопа, при цьому тканини повинні постійно зволожуватися ізотонічним розчином натрію хлориду. Проте тривалість такого спостереження обмежена. Найкращі результати дає метод вживлення прозорих камер в організм тварини.

Найбільш зручним органом для вживлення таких камер та подальшого спостереження є вухо будь-якої тварини (наприклад, кролика). Ділянку вуха з прозорою камерою поміщають на предметний столик мікроскопа і в цих умовах вивчають динаміку зміни клітин та тканин протягом тривалого часу. Так можуть вивчатися процеси виселення лейкоцитів із кровоносних судин, різні стадії утворення сполучної тканини, капілярів, нервів та інші процеси. Як природну прозору камеру можна використовувати око експериментальних тварин. Клітини, тканини або зразки органів поміщають у рідину передньої камери ока в кут, утворений рогівкою та райдужкою, і ведуть спостереження через прозору рогівку. Таким чином було проведено трансплантацію заплідненої яйцеклітини та простежено ранні стадії розвитку зародка. Мавпам було пересаджено невеликі шматочки матки та вивчено зміни її слизової оболонки у різні фази менструального циклу.

Широке застосування знайшов метод трансплантаціїклітин крові та кісткового мозку від здорових тварин-донорів тваринам-реципієнтам, підданим смертельному опроміненню. Тварини-реципієнти після трансплантації залишалися живими внаслідок приживлення донорських клітин, що утворюють у селезінці колонії кровотворних клітин. Дослідження числа колоній та їх клітинного складу дозволяє виявляти кількість родоначальних кровотворних клітин та різні стадії їх диференціювання. За допомогою методу колонієутворення встановлені джерела розвитку всіх клітин крові.

Вітальне та суправітальне фарбування.При вітальному (прижиттєвому) фарбуванні клітин та тканин барвник вводять в організм тварини, при цьому він вибірково забарвлює певні клітини, їх органели чи міжклітинну речовину. Наприклад, за допомогою трипанового синього чи літієвого карміну виявляють фагоцити, а за допомогою алізарину – новостворений матрикс кістки.

Суправітальнимфарбуванням називають фарбування живих клітин, виділених із організму. У такий спосіб виявляють молоді форми еритроцитів – ретикулоцити крові (барвник діамантовий крезиловий блакитний), мітохондрії у клітинах (барвник зелений янус), лізосоми (барвник нейтральний червоний).

Дослідження живих клітин та тканин у культурі (in vitro). Цей метод є одним із найпоширеніших. Виділені з організму людини або тварин клітини, маленькі зразки тканин або органів поміщають у скляні або пластмасові судини, що містять спеціальне живильне середовище - плазму крові, ембріональний екстракт, а також штучні середовища.

Розрізняють суспензійні культури (клітини зважені в середовищі), тканинні, органні та моношарові культури (експлантовані клітини утворюють на склі суцільний шар). Забезпечуються стерильність середовища та температура, що відповідає температурі тіла. У цих умовах клітини протягом тривалого часу зберігають основні показники життєдіяльності – здатність до зростання, розмноження, диференціювання, руху. Такі культури можуть існувати багато днів, місяців і навіть років, якщо оновлювати середовище культивування і пересаджувати життєздатні клітини в інші судини. Деякі види клітин завдяки змінам у їхньому геномі можуть зберігатися і розмножуватися в культурі, утворюючи безперервні клітинні лінії. У розробку методів культивування клітин та тканин великий внесок зробили А. А. Максимов, А. В. Румянцев, Н. Г. Хлопін, А. Д. Тимофєєвський, Ф. М. Лазаренко. В даний час одержані клітинні лінії фібробластів, міоцитів, епітеліоцитів, макрофагів, які існують багато років.

Використання методу культивування дозволило виявити низку закономірностей диференціювання, злоякісного переродження клітин, взаємодій клітин із вірусами та мікробами. p align="justify"> Особливу значущість метод культивування тканин має для проведення експериментальних спостережень. Взяті з організму людини клітини при пункції чи біопсії можуть у культурі тканин використовуватися визначення статі, спадкових захворювань, злоякісного переродження, виявлення дії низки токсичних речовин.

Клітинні культури широко застосовуються для гібридизації клітин.

Розроблено методи поділу тканин на клітини, виділення окремих типів клітин та їх культивування. Спочатку тканину перетворюють на суспензію клітин шляхом руйнування міжклітинних контактів та позаклітинного матриксу за допомогою протеолітичних ферментів (трипсин, колагеназа) та сполук, що зв'язують Са 2+ (за допомогою ЕДТА – етилендіамінтетраацетату). Далі отриману суспензію поділяють на фракції клітин різних типів за допомогою центрифугування, що дозволяє відокремити більш важкі клітини від легень, великі від малих, або шляхом прилипання клітин до скла або пластмаси, здатність до якого різні типи клітин неоднакова. Для забезпечення специфічного прилипання клітин до поверхні скла використовують антитіла, що специфічно зв'язуються з клітинами одного типу. Приліплі клітини потім відокремлюють, руйнуючи

матрикс ферментами, при цьому отримують суспензію однорідних клітин. Більш тонким методом поділу клітин є мічення антитілами, пов'язаними з флюоресцентними барвниками. Мічені клітини відокремлюються від немічених за допомогою сортера (електронного флюоресцентно-активованого клітинного аналізатора). Клітинний аналізатор сортує за 1 секунду близько 5000 клітин. Виділені клітини можна вивчати за умов культивування.

Метод культивування клітин дозволяє вивчати їх життєдіяльність, розмноження, диференціювання, взаємодію Космосу з іншими клітинами та інших.

Культури зазвичай готують із суспензії клітин, отриманої вищеописаним методом дисоціації тканини. Більшість клітин не здатні рости в суспензії, їм необхідна тверда поверхня, в якості якої використовують поверхню пластикової чашки, іноді з компонентами позаклітинного матриксу, наприклад колагену. Первинними культурами називають культури, приготовані безпосередньо після першого етапу фракціонування клітин, вторинними - культури клітин, пересаджені з первинних культур у нове середовище. Можна послідовно перевивати клітини протягом тижнів і місяців, при цьому клітини зберігають характерні для них ознаки гістогенети (наприклад, клітини епітелію утворюють пласти). Вихідним матеріалом для клітинних культур зазвичай служать ембріональні тканини та тканини новонароджених.

Як поживні середовища використовують суміші солей, амінокислот, вітамінів, сироватки крові, екстракт курячих ембріонів, ембріональну сироватку та ін. В даний час розроблені спеціальні середовища для культивування різних типів клітин. Вони містять один або кілька білкових факторів росту, необхідних клітин для життєдіяльності та розмноження. Наприклад, зростання нервових клітин необхідний чинник зростання нервів.

У більшості клітин у культурі спостерігається певна кількість поділів (50-100), а потім вони гинуть. Іноді в культурі з'являються мутантні клітини, які множаться нескінченно і утворюють клітинну лінію (фібробласти, епітеліоцити, міобласти та ін.). Мутантні клітини відрізняються від ракових клітин, що також здатні до безперервного поділу, але клітини ростуть без прикріплення до твердої поверхні. Ракові клітини в культуральних чашках утворюють щільнішу популяцію, ніж популяції звичайних клітин. Аналогічну властивість можна викликати експериментально у нормальних клітин шляхом трансформації їх пухлинними вірусами або хімічними сполуками, при цьому утворюються неопластично трансформовані клітинні лінії. Клітинні лінії нетрансформованих та трансформованих клітин можна довго зберігати за низьких температур (-70 °С). Генетичну однорідність клітин посилюють клонуванням, коли з однієї клітини при її послідовному розподілі одержують велику колонію однорідних клітин. Клон - це населення клітин, що походять з однієї клітини-попередника.

Клітинні гібриди.При злитті двох клітин різних типів утворюється гетерокаріон – клітина з двома ядрами. Для отримання гетерокаріону суспензію клітин обробляють поліетиленгліколем або інактивованими вірусами для пошкодження плазмолем клітин, після чого клітини здатні до злиття. Наприклад, неактивне ядро ​​еритроциту курки стає активним (синтез РНК, реплікація ДНК) при злитті клітин та перенесенні в цитоплазму іншої клітини, що росте в культурі тканини. Гетерокаріон здатний до мітозу, внаслідок чого утворюється гібридна

клітини. Оболонки ядер у гетерокаріону руйнуються, та його хромосоми об'єднуються у одному великому ядрі.

Клонування гібридних клітин призводить до утворення гібридних клітинних ліній, що використовуються для вивчення геному. Наприклад, у гібридній клітинній лінії «миша-людина» встановлено роль хромосоми 11 людини у синтезі інсуліну.

Гібридоми.Клітинні лінії гібридом використовують для отримання моноклональних антитіл. Антитіла виробляються плазмоцитами, які утворюються з-лімфоцитів при імунізації. Певний вид антитіл одержують за імунізації мишей конкретними антигенами. Якщо клонувати такі імунізовані лімфоцити, можна отримати велику кількість однорідних антитіл. Однак час життя В-лімфоцитів у культурі обмежений. Тому виробляють їх злиття з "безсмертними" пухлинними клітинами (В-лімфоми). В результаті утворюються гібридоми (гібрид-клітина з геномом від двох різних клітин; ома - закінчення в назвах пухлин). Такі гібридоми здатні розмножуватися тривало в культурі та синтезувати антитіла певного виду. Кожен клон гібридоми є джерелом моноклональних антитіл. Всі молекули антитіл цього виду мають однакову специфічність зв'язування антигенів. Можна отримувати моноклональні антитіла проти будь-якого білка, що міститься в клітині, та використовувати їх для встановлення локалізації білків у клітині, а також для виділення білка із суміші (очищення білків), що дозволяє досліджувати структуру та функцію білків. Моноклональні антитіла застосовують також у технології клонування генів.

Антитіла можна використовувати для вивчення функції різних молекул, вводячи їх через плазмолемму безпосередньо в цитоплазму клітин тонкою скляною піпеткою. Наприклад, введення антитіл до міозину в цитоплазму заплідненої яйцеклітини морського їжака зупиняє поділ цитоплазми.

Технологія рекомбінантної ДНК.Класичні генетичні методи дозволяють вивчати функцію генів, аналізуючи фенотипи мутантних організмів та його потомства. Технологія рекомбінантних ДНК доповнює ці методи, дозволяє проводити детальний хімічний аналіз генетичного матеріалу та отримувати у великих кількостях клітинні білки.

Методи гібридизації широко використовують у сучасній біології вивчення структури генів та його експресії.

2.4 МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ ХІМІЧНОГО СКЛАДУ І МЕТАБОЛІЗМУ КЛІТИН І ТКАНИН

Для вивчення хімічного складу біологічних структур – локалізації речовин, їх концентрації та динаміки у процесах метаболізму застосовують спеціальні методи дослідження.

Цито- та гістохімічні методи.Ці методи дозволяють виявляти локалізацію різних хімічних речовин у структурах клітин, тканин і орга-

нов - ДНК, РНК, білків, вуглеводів, ліпідів, амінокислот, мінеральних речовин, вітамінів, активність ферментів. Ці методи засновані на специфічності реакції між хімічним реактивом і субстратом, що входять до складу клітинних та тканинних структур, та фарбуванні продуктів хімічних реакцій. Для контролю специфічності реакції найчастіше застосовують відповідні ферменти. Наприклад, для виявлення в клітинах рибонуклеїнової кислоти (РНК) часто використовують галоціанін - барвник з основними властивостями, а наявність РНК підтверджують контрольною обробкою рибонуклеазою, що розщеплює РНК. Галлоціанін забарвлює РНК у синьо-фіолетовому кольорі. Якщо зріз попередньо обробити рибонуклеазою, а потім пофарбувати галоціаніном, відсутність фарбування підтверджує наявність у структурі рибонуклеїнової кислоти. Опис численних цито-і гістохімічних методів дається у спеціальних посібниках.

Поєднання гістохімічних методів з методом електронної мікроскопії призвело до розвитку нового перспективного спрямування електронної гістохімії.Цей метод дозволяє вивчати локалізацію різних хімічних речовин не лише на клітинному, а й на субклітинному та молекулярному рівнях. Для вивчення макромолекул клітин використовують дуже чутливі методи із застосуванням радіоактивних ізотопів та антитіл, що дозволяють виявити навіть невеликий вміст молекул (менше

1000).

Радіоактивні ізотопи при розпаді ядра випромінюють заряджені частинки (електрони) або випромінювання (наприклад, гамма-промені), які можна зареєструвати спеціальними приладами. Радіоактивні ізотопи використовують у методі радіоавтографії. Наприклад, за допомогою радіоізотопів 3 Н-тимідину досліджують ДНК ядра, за допомогою 3 Н-уридину – РНК.

Метод радіоавтографії.Цей метод дає можливість найповніше вивчити обмін речовин у різних структурах. В основі методу лежить використання радіоактивних елементів (наприклад фосфору 32 Р, вуглецю 14 С, сірки 35 S, водню 3 Н) або мічених ними сполук. Радіоактивні речовини в гістологічних зрізах виявляють за допомогою фотоемульсії, яку наносять на препарат і виявляють. У ділянках препарату, де фотоемульсія стикається з радіоактивною речовиною, відбувається фотореакція,у результаті якої утворюються засвічені ділянки (треки). Цим методом можна визначати, наприклад, швидкість включення мічених амінокислот до білків, утворення нуклеїнових кислот, обмін йоду в клітинах щитовидної залози та ін.

Методи імунофлюоресцентного та імуноцитохімічного аналізу. Застосування антитіл.Антитіла – захисні білки, що виробляються плаз-моцитами (похідними В-лімфоцитів) у відповідь на дію чужорідних речовин (антигенів). Кількість різних форм антитіл сягає мільйона. Кожне антитіло має ділянки для «розпізнавання» молекул, що викликали синтез цього антитіла. У зв'язку з високою специфічністю антитіл щодо антигенів вони можуть бути використані для виявлення будь-яких клітин білків. Метод заснований на реакціях антиген-антитіло. Кожна клітина організму має специфічний антигенний склад, який головний

ним чином визначається білками. Для посилення специфічності реакції застосовують моноклональні антитіла, що утворюються лінією клітин - клонами (одна лінія - один клон), отриманої методом гібридом з однієї клітини. Метод гібридом дозволяє отримувати моноклональні антитіла з однаковою специфічністю та у необмежених кількостях. Антитіла можна використовувати для вивчення антигенів як на світловому, так і ультраструктурному рівнях за допомогою електронного мікроскопа. У клінічній діагностиці широкого застосування набули методи імуногістохімії на парафінових зрізах. Запропоновано велику кількість молекулярних маркерів та методів виявлення білків проміжних філаментів, проліферативних, диференціювальних та апоптозних білків у клітинах. Для стандартизації обробки препаратів використовується імуностенер - пристрій, за допомогою якого всі операції проводяться без втручання з боку дослідника.

Методи імунофлюоресцентного та імуногістохімічного аналізів широко та ефективно використовуються у наукових дослідженнях та в лабораторній діагностиці. Продукти реакції можна фарбувати флюоресцирующими барвниками і виявляти в люмінесцентному мікроскопі або використовувати спеціальні набори реактивів, які фарбують білки, що досліджуються, і аналізувати препарати за допомогою світлового мікроскопа. Ці методи застосовуються вивчення процесів диференціювання клітин, виявлення у яких специфічних хімічних сполук і структур. Методи дозволяють з високою точністю охарактеризувати функціональний стан клітин, виявити гістогенетичну приналежність та трансформацію клітини при онкологічних захворюваннях.

Фракціонування клітинного вмісту.Фракціонувати структури та макромолекули клітин можна різними методами – ультрацентрифугуванням, хроматографією, електрофорезом. Докладніше ці методи описані у підручниках біохімії.

Ультрацентрифугування.За допомогою цього методу клітини можна розділити на органели та макромолекули. Спочатку руйнують клітини осмотичним шоком, ультразвуком чи механічним впливом. При цьому мембрани (плазмолема, ендоплазматична мережа) розпадаються на фрагменти, з яких формуються дрібні бульбашки, а ядра та органели (мітохондрії, комплекс Гольджі, лізосоми та пероксисоми) зберігаються інтактними і перебувають у суспензії, що утворює.

Для розділення вищевказаних компонентів клітини застосовують високошвидкісну центрифугу (80 000-150 000 об./хв). Спочатку осідають (сиді-ментуються) на дні пробірки більші частини (ядра, цитоскелет). При подальшому збільшенні швидкостей центрифугування надосадових фракцій послідовно осідають більш дрібні частинки - спочатку мітохондрії, лізосоми і пероксисоми, потім мікросоми і дрібні бульбашки і, нарешті, рибосоми і великі макромолекули. При центрифугуванні різні фракції осідають із різною швидкістю, утворюючи в пробірці окремі смуги, які можна виділити та дослідити. Фракціоновані клітинні екстракти (безклітинні системи) широко-

ко використовують для вивчення внутрішньоклітинних процесів, наприклад вивчення біосинтезу білка, розшифровки генетичного коду та інших.

Хроматографіяшироко використовується для фракціонування білків.

Електрофорездозволяє розділити білкові молекули з різним зарядом при поміщенні їх водних розчинів (або в твердому пористому матриксі) в електричному полі.

Методи хроматографії та електрофорезу застосовують для аналізу пептидів, одержуваних при розщепленні білкової молекули, та отримання так званих пептидних карт білків. Докладно ці методи описані у підручниках біохімії.

Вивчення хімічного складу живих клітинДля вивчення розподілу речовин та їх метаболізму у живих клітинах використовують методи ядерного магнітного резонансу та мікроелектродну техніку.

Ядерний магнітний резонансдозволяє вивчати малі молекули низькомолекулярних речовин. Зразок тканини містить атоми, що характеризуються здатністю поглинати енергію на різних резонансних частотах. Діаграма поглинання на резонансних частотах даного зразка складе його спектр ЯМР. У біології сигнал ЯМР від протонів (ядер водню) широко використовується для вивчення білків, нуклеїнових кислот та ін. Для вивчення макромолекул усередині живої клітини часто застосовують ізотопи 3 Н, 14 С, 32 Р для отримання сигналу ЯМР та спостереження за його зміною у процесі життєдіяльності клітини. Так, ізотоп фосфору використовується для вивчення м'язового скорочення – змін вмісту у тканинах АТФ та неорганічного фосфату. Ізотоп вуглецю дозволяє за допомогою ЯМР досліджувати багато процесів, у яких бере участь глюкоза. Використання ЯМР обмежене його низькою чутливістю: в 1 г живої тканини повинно бути не менше 0,2 ммоль досліджуваної речовини. Перевагою методу є його нешкідливість живих клітин.

Мікроелектродна техніка.Мікроелектроди є скляні трубочки, заповнені електропровідним розчином (зазвичай розчин КС1 у воді), діаметр кінця яких вимірюється частками мікрометра. Кінчик такої трубочки можна вводити в цитоплазму клітини через плазмолему та визначати концентрацію іонів Н+, Na+, К+, С1 - , Са 2+, Mg 2+, різницю потенціалів на плазмолемі, а також виробляти ін'єкцію молекул у клітину. Для визначення концентрації конкретного іона використовують іонселективні електроди, які заповнюють іонообмінною смолою, що проникає тільки даного іона. Мікроелектродну техніку застосовують вивчення транспорту іонів через спеціальні іонні канали (спеціалізовані білкові канали) в плазмолемме. При цьому використовують мікроелектрод, який щільно притискають до відповідної ділянки плазмолеми. Цей метод дозволяє досліджувати функцію одиночної білкової молекули. Зміну концентрації іонів усередині клітини можна визначити за допомогою люмінесцентних індикаторів. Наприклад, вивчення внутрішньоклітинної концентрації Са 2+ використовують люмінесцентний білок акварин (виділений з медузи), який випромінює світло у присутності іонів Са 2+ і реагує зміну концентрації останнього не більше 0,5-10 мкмоль. Синтезовано також флюоресцентні індикатори, що міцно зв'язуються з Са 2+ . Створення різних нових типів внутрішньоклітинних індикаторів та сучасних способів аналізу зображень дозволяє точно та швидко визначати внутрішньоклітинну концентрацію багатьох низькомолекулярних речовин.

2.5. КІЛЬКІСНІ МЕТОДИ

В даний час поряд з якісними методами розроблені та застосовуються кількісні гістохімічні методи визначення вмісту різних речовин у клітинах та тканинах. Особливість кількісних гістохімічних (на відміну біохімічних) методів дослідження полягає у можливості вивчення концентрації хімічних компонентів у конкретних структурах клітин та тканин.

Цитоспектрофотометрія- метод вивчення хімічного складу клітини, заснований на вибірковому поглинанні тими чи іншими речовинами променів з певною довжиною хвилі. За інтенсивністю поглинання монохроматичного світла, що залежить від концентрації речовини, проводиться визначення вмісту в клітині. Так, наприклад, визначається вміст ДНК в ядрі, РНК та сумарного білка в цитоплазмі та ін.

Цитоспектрофлюориметрія- метод кількісного вивчення внутрішньоклітинних речовин за спектрами їхньої флюоресценції або за інтенсивністю флюоресценції при опроміненні препарату заздалегідь обраної довжиною світлової хвилі (цитофлюориметрія). При цьому використовуються флюорохроми, що кількісно зв'язуються з речовинами клітини (ДНК, РНК, білками та ін.).

Сучасні мікроскопи - цитофлюориметри дозволяють виявити в різних структурах малі кількості речовини (до 10 -14 -10 -16 г) та оцінити локалізацію досліджуваних речовин у мікроструктурах.

Інтерферометрія.Цей метод дозволяє оцінити суху масу та концентрацію щільних речовин у живій та фіксованій клітинах. За допомогою цього методу, наприклад, можна встановити сумарний вміст білків у живих та фіксованих клітинах.

2.6. МЕТОДИ АНАЛІЗУ ЗОБРАЖЕННЯ КЛІТИННИХ І ТКАНИННИХ СТРУКТУР

Отримані зображення мікрооб'єктів у мікроскопі, на екрані дисплея, на електронних мікрофотографіях можуть піддаватися спеціальному аналізу - виявлення морфометричних, денситометричних параметрів та їхньої статистичної обробки. Морфометричні методи дозволяють визначати за допомогою спеціальних сіток (Е. Вейбеля, А. А. Глаголєва, С. Б. Стефанова) кількість будь-яких структур, площі їх перерізів, діаметри та ін. Зокрема в клітинах можуть бути виміряні площі ядер, цитоплазми, їх діаметри, ядерно-цитоплазматичні відносини та інших. Існують ручна морфометрія і автоматизована морфометрія, коли всі параметри вимірюються і реєструються в приладі автоматично.

Все більшого поширення набувають автоматизовані системи обробки зображень (АСОІз), що дозволяють найбільш ефективно реалізувати перераховані вище кількісні методи для вивчення клітин та тканин. При цьому аналітичні можливості кількісної мікроскопії доповнюються методами аналізу та розпізнавання зразків.

ними на обробці за допомогою електронно-обчислювальних машин (ЕОМ) інформації, що витягується з зображень клітин та тканин. По суті можна говорити про пристрої, які не тільки підсилюють оптичні можливості зорового аналізатора людини, але й аналітичні можливості, що його багато разів розширюють. Це дозволяє отримувати нову інформацію про процеси, що не виявляються раніше, моделювати і прогнозувати їх розвиток у клітинах і тканинах.

Водночас участь в експерименті ЕОМ вимагає від дослідника нового підходу до його проведення, володіння навичками складання алгоритмів процесу дослідження, точності міркувань та, зрештою, підвищення науково-методичного рівня дослідження.

Таким чином, застосування нових методів досліджень у гістології, цитології та ембріології дозволяє з'ясувати загальні закономірності організації тканин та клітин, структурні основи біохімічних процесів, що визначають функцію конкретних структурних компонентів клітини.

Контрольні питання

1. Які основні засади виготовлення препаратів для світлової мікроскопії? За допомогою яких методів можна діагностувати функціональний стан клітки?

2. Які структури клітини можна знайти за допомогою різних методів мікроскопії?

3. Назвіть основні групи гістологічних барвників. Що означають терміни "оксифілія", "базофілія", "метахромазія"?

Гістологія, ембріологія, цитологія: підручник / Ю. І. Афанасьєв, Н. А. Юрина, Є. Ф. Котовський та ін. – 6-те вид., перероб. та дод. – 2012. – 800 с. : іл.